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      文獻解讀

      circRNA測序案例解讀-醫學

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      2019-01-21 15:12    編輯:admin
      環狀RNA(circRNA)表達圖譜揭示circHIPK3通過吸附多個miRNA起到調節細胞生長增殖的作用
      Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs
      DOI: 10.1038/ncomms11215
       
       

      背景

             環狀RNA(circRNA)是一種通過反向剪接形成的、通過共價鍵閉合單鏈環形RNA分子。circRNA曾被認為是剪接過程中的副產物,但是最近的研究發現circRNA在各種細胞系和不同物種中都大量存在。與線性RNA相比,circRNA在有機體內更加穩定。circRNA主要存在于細胞質中,也有一些在外泌體中。最近的研究發現反向互補序列和一些特殊的蛋白質能夠促進外顯子的環化,進而形成circRNA。文獻報道,大量的circRNA在小鼠神經發育和人類上皮間質轉化過程中上調,這些報道揭示了circRNA可能不是剪接的副產物,而是具有調控作用。此外,最近的研究還闡述了circRNA可以通過吸附miRNA從而起到調控基因表達的作用。其中一個例子便是ciRS-7(也稱CDR1as),作為miRNA的抑制劑,這個circRNA上具有70多個miR-7的綁定位點。然而僅有幾個circRNA上含有多個miRNA綁定位點,并且大多數circRNA的功能仍然未知。
      在人類多個細胞系和腦組織中已被鑒定到circRNA。本研究利用RNA-Seq數據在人類6個正常組織和7個癌癥組織中鑒定到約27000個circRNA(至少有兩條不同的讀序支持),并且發現circHIPK3對細胞的生長增殖起到調節作用。
       

      主要材料方法

      1. 材料與數據
             6個正常組織:腦、結腸、心臟、肝臟、肺和胃(Clontech Laboratories, Inc. Palo Alto, CA)

             7個癌癥組織:膀胱移行細胞癌(BLCA)、乳腺癌(BC)、結腸直腸癌(CRC)、肝細胞癌(HCC)、胃癌(GC)、腎清細胞癌(KCA)和前列腺腺癌(PRAD)。其中人類原發性肝細胞癌和臨近的非癌組織來自中國江蘇省啟東肝癌研究所,其他的六種癌癥組織來自上海復旦大學腫瘤中心。
             使用Illumina HiSeq 平臺得到6個正常組織和7個癌癥組織的去rRNA的轉錄組測序(ribosomal RNA-depleted RNA-Seq)數據。這些轉錄組測序數據在NCBI上的編碼是GSE77661。
       
      2. 主要分析流程

             (1)人類circRNA的鑒定和circRNA表達量的計算
             使用Tophat2軟件,將測序的FASTQ數據比對到人類基因組(GRCh37/hg19版本,來自UCSC基因組數據庫)。鑒定circRNA所使用的軟件為find_circ。circRNA的表達量計算使用的是SRPBM公式(SRPBM=支持circRNA的讀序數量/比對上的讀序數量/讀序長度)。成環比(circular ratio,CR)的計算公式為CR=支持circRNA的讀序數量/(支持circRNA的讀序數量+支持線性轉錄本的讀序數量)。SRPBM和CR這兩個值被用來篩選高表達的circRNA,并且繼續后續的分析研究。
             (2)人類circRNA的注釋
             根據circRNA的位置信息確定其在基因組上的母基因,再按照母基因的注釋來確定circRNA的注釋。其中基因組上編碼基因的注釋信息來自RefSeq和UCSC數據庫。
             (3)AGO2蛋白綁定位點的預測
             AGO2蛋白綁定位點的序列信息下載自doRiNA(http://dorina.mdc-berlin.de)。通過這些下載的信息與circHIPK3的基因組序列比對,確定circHIPK3上的AGO2蛋白綁定位點。
             (4)涉及的實驗驗證方法(簡要)
             本次實驗涉及的實驗方法有qRT–PCR、RNA FISH、質粒載體構建、northern blotting、CRISPR/Cas9技術敲除目標DNA片段、轉染(oligonucleotide transfection)、RNA免疫沉淀(RIP)、報告基因檢測(Luciferase reporter assay)等。
       

      主要結果

      1. 人類正常組織和癌癥組織中cicRNA的鑒定
             在6個正常組織和7個癌癥組織中一共鑒定到27,296個候選circRNA(至少有兩條不同的讀序支持,圖1a),其中19,071個circRNA已被先前的研究報道,8,225個circRNA是新鑒定的。超過80%的circRNA包含有蛋白編碼基因的外顯子(圖1b)。大多數鑒定的circRNA的長度小于1500nt,并且circRNA長度的中位數大約為500nt(圖1c)。通過SRPBM(spliced reads per billion mapping)對circRNA的表達量的標準化,發現circRNA在正常組織中的表達呈現組織特異性(圖1d,圖中的值是將SRPBM值取log10對數)。而circRNA在癌癥組織和正常組織中的表達也存在差異。通過對正常組織和癌癥組織的circRNA表達量的Wilcoxon秩和檢驗(Wilcoxon rank-sum test)發現,circRNA的表達量在BRCA、CRC、GC、HCC和PRAD中顯著下調,在BLCA和KCA中顯著上調(圖1e)。此外,還有一些circRNA只在癌癥組織或者正常組織中表達(圖1f)。
       
      圖1 人類正常組織和癌癥組織中的circRNA表達情況
       
       
      2. 人類細胞circRNA的特征

             一個蛋白編碼基因可以產生一個或者多個circRNA(圖2a)。其中一個例子便是PTK2基因能夠產生47個不同的circRNA。通過對來自一個基因位點的circRNA的表達量分析,發現50%母基因能夠產生一個表達量顯著高于其他的circRNA(圖2b),這也就是說一個基因位點往往能夠產生一個主要表達的circRNA。
      成環比(circular ratio,CR)是一個計算circRNA豐度的指標,它是反向剪接讀序數量除以反向剪接讀序數量和線性剪接讀序數量和的比值(圖2c)。通過對CR值和SRPBM值的篩選(5’端CR>0.2,3’端CR>0.2,并且SRPBM>1),發現了990個高表達豐度的circRNA(圖2d紅色圓點),并且其中的大多數circRNA的表達量高于線性基因的表達量。此外,這些高表達的circRNA的反向剪接接口附近的內含子的長度也比一般的circRNA長(圖2e)。

             有趣的是,研究人員發現來自HIPK3基因的第二個外顯子的circRNA(circHIPK3)具有很高的表達量和CR值(圖2d藍色圓點)。HIPK3基因除了產生circHIPK3,還能夠產生其他四種circRNA,分別為circHIPK3.2、circHIPK3.3、circHIPK3.4、circHIPK3.5(圖3a),但是有高達1880條讀序支持circHIPK3的反向剪接接口。circHIPK3的存在能夠通過Sanger測序被實驗證實(圖3a)。通過qRT-PCR分析發現,circHIPK3的表達量顯著高于其母基因的表達量(圖3b,除了在肝臟組織中),并且circHIPK3在腦組織中特別高表達。通過比較circHIPK3和HIPK3轉錄本的穩定性發現,circHIPK3的半衰期超過了24小時,而HIPK3轉錄本的半衰期小于4個小時(圖3c)。利用RNase R核酸外切酶(降解線性RNA)處理實驗發現circHIPK3確實是環形的(圖3d)。此外,通過細胞核和細胞質RNA的qRT-PCR分析和熒光原位雜交(FISH)發現,circHIPK3是位于細胞質的環狀RNA(圖3e和f)。
       
       
      圖2  人類細胞中circRNA的特征
       
       
      圖3  人類細胞中circHIPK3的特征
       
      3. circHIPK3的形成

             分析發現HIPK3基因的第二個外顯子(產生circHIPK3)附近的內含子上存在高度反向互補的Alu重復序列,包括circHIPK3上游內含子上的28個SINE重復序列和下游內含子上的51個SINE重復序列(圖4a)。前期研究表明circRNA附近的反向互補序列能夠促進circRNA的形成,因此研究人員克隆了包含HIPK3基因第二個外顯子以及上游1039nt和下游988nt的序列(圖4b)。將該表達載體轉染后,northern blot和qRT-PCR分析都發現了circHIPK3產物(圖4c和d)。然后只有一邊或者兩個都沒有Alu重復序列的表達載體,都不能檢測到circHIPK3產物(圖4c和d)。這也表明,兩段反向的重復序列對circRNA的形成必不可少。
      此外,研究人員還用CRISPR/Cas9在細胞內刪除重復序列以探究重復序列對circRNA形成的影響。gRNA按照圖4a所示設計。結果顯示,下游Alu片段的缺失抑制了circHIPK3的形成(圖4e),而上游Alu片段的缺失卻促進了circHIPK3的形成(圖4f)。猜想上游內含子上的其他Alu片段與下游的Alu片段配成了反向互補堿基對。進一步刪除上游內含子大部分片段,發現circHIPK3的表達顯著下調(圖4g),但是HIPK3轉錄本的表達并沒有受很大影響。這些研究表明反向互補的重復序列是circHIPK3的形成所必需的。
       
       
      圖4 兩端長內含子序列促使circHIPK3的形成
       
      4. 沉默circHIPK3能夠抑制人類細胞增殖

             研究人員通過RNA干擾技術沉默circHIPK3和HIPK3基因的表達。他們設計了三種小干擾RNA(圖5a):si-circHIPK3靶向circHIPK3的反向剪接接口序列,si-HIPK3靶向僅在HIPK3上的序列,si-both靶向circHIPK3和HIPK3都存在的序列。結果顯示,si-circHIPK3僅影響circHIPK3的表達而不影響HIPK3的表達,si-both影響circHIPK3和HIPK3的表達(圖5b)。隨后的細胞增殖實驗表明,在不同細胞類型中的circHIPK3下調都顯著地抑制了細胞的增殖(圖5c-e)。此外,EdU實驗也表明circHIPK3的下調抑制了人類細胞的增殖(圖5f和g)。這些結果都表明circHIPK3可能參與了人類細胞的增殖調節。
       
      圖5 沉默circHIPK3抑制人類細胞的增殖
       
      5. circHIPK3能夠作為分子海綿吸附miRNA

             在線的AGO2免疫沉淀反應預測(doRiNA)表明,circHIPK3上有多個AGO2蛋白的結合位點(圖6a)。為了驗證這個預測結果,研究人員在HEK-293 T細胞系中構建了能穩定表達的Flag-AGO2和Flag-GFPRNA免疫沉淀體系(RIP),并且發現Flag-AGO2細胞系中的內源性circHIPK3的表達豐度高(圖6b)。此外,研究人員還構建了一個circHIPK3片段,并且將它插入到熒光素酶報告基因的下游(LUC+circHIPK3)。他們猜測,通過circHIPK3吸附miRNA,以及miRNA介導的去甲基化和隨后的核酸外切酶降解,能夠抑制熒光素酶的活性。而實驗結果發現,LUC+circHIPK3質粒上3’端非翻譯區上的circHIPK3序列,能夠引起熒光素酶活性的下調(圖6c)。并且,敲除內源性circHIPK3也能降低熒光素酶的活性。相反的是,過表達circHIPK3能夠提高熒光素酶的活性(圖6c)。這些結果都表明circHIPK3可能有AGO2和miRNA的結合位點。
      為了證明circHIPK3確實吸附了miRNA,研究人員進行了miRNA文庫的熒光素酶篩選。所有miRNA都被插入到熒光素酶報告基因上,并且被轉染到HEK-293 T細胞中。在424個實驗的miRNA中,有9個(miR-124、miR-152、miR-193a、miR-29a、miR-29b、miR-338、miR-379、miR-584和miR-654)能夠至少降低熒光素酶30%的活性(圖6d)。但是qRT–PCR分析發現這些miRNA并不能顯著降低circHIPK3的表達水平,也就是說這些miRNA可能并不是結合到circHIPK3上并且降解circHIPK3。隨后,TargetScan和PicTar軟件的預測發現,這些miRNA上至少包含一個與circHIPK3的結合位點(圖6e)。因此,研究人員將這些miRNA上可能與circHIPK3的結合位點突變掉,發現轉染這些突變后的質粒并沒有對熒光素酶的活性產生顯著影響(圖6f)。并且,轉染突變掉與miRNA結合位點的circHIPK3表達載體,也沒有對熒光素酶的活性產生影響。這些結果都表明,circHIPK3可能能夠作為分子海綿吸附miRNA。

             曾有研究表明,以上找到的9個可能被circHIPK3吸附的miRNA在不同的細胞中都起到生長抑制的作用。研究人員因此將單個miRNA分別轉染到到HEK-293 T細胞中。細胞增殖實驗發現,4個miRNA(miR-124、miR-193、miR-379和miR-654)能夠顯著抑制HEK-293 T細胞的增殖,其中miR-124表現更為明顯(圖7a)。通過捕獲體系中的miR-124成分,發現circHIPK3的表達量能夠提高5倍以上(圖7b)。細胞定位實驗發現circHIPK3與miR-124之間存在相互作用(圖7c)。此外,在敲除circHIPK3之后,miR-124的兩個靶基因IL6R和DLX2(這兩個基因都與促進細胞增殖相關)的表達量都出現下調,并且circHIPK3的異位表達能夠改善IL6R和DLX2表達量下調的局面(圖7d)。circHIPK3的異位表達還能夠減弱miR-124的增殖抑制作用(圖7e)。研究人員還調查了不同組織中circHIPK3和miR-124的表達水平和相關性。結果表明,circHIPK3和miR-124在腦組織中都高表達,并且他們的表達量在人類的多種正常組織中呈正向相關(圖7f)。以上這些結果都表明,circHIPK3能夠直接綁定miR-124,并且抑制它的活性。
       
       
      圖6 人類細胞中circHIPK3可作為miRNA分子海綿吸附多個miRNA
       
       
       
      圖7 circHIPK3吸附miR-124并且抑制miR-124的活性
       

      小結

             1. 本文在人類正常組織和癌癥組織中鑒定了大量的circRNA,并且這些circRNA表現出組織特異性和癌癥特異性。大多數circRNA的表達量較低,但是有些circRNA在基因位點上的表達量很高。此外,有大量的circRNA在不同組織中表達,或者在正常與癌癥組織中差異表達,這些circRNA可能行駛著重要功能。
             2. 大多數circRNA來源于mRNA前體。其中circHIPK3是來自于HIPK3基因第二個外顯子的circRNA。circHIPK3兩端附近是含有大量Alu重復序列的內含子,這些反向互補的重復序列可能與外顯子的環化(circHIPK3形成)相關。
             3. circHIPK3可以在人類細胞中通過吸附miRNA起到調節細胞生長增殖的作用。
       
       
       

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