lncRNA測序案例解讀-農學
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植物中轉座子促成的抗性相關的基因間區長非編碼RNA（lincRNA）
Transposable elements (TEs) contribute to stress-related long intergenic noncoding RNAs in plants
The Plant Journal (2017) 90, 133–146
doi: 10.1111/tpj.13481
擬南芥、水稻和玉米RNA-Seq，包括三個生物學重復（GSE76798）
2. 主要分析流程
（1）全基因組lincRNA的鑒定（具體流程見圖1）；
（2）lincRNA中TE的含量、種類等特征；
（3）擬南芥中TE-lincRNA的表達譜特征；
（4）轉基因驗證TE-lincRNA對非生物脅迫的響應；
（5）ddm1突變體植株中lincRNA的特征。
為了系統地鑒定TE-lincRNA，該課題組對三個物種的兩周大幼苗進行了鏈特異性轉錄組測序。由于在人類和小鼠中早已報道反轉錄轉座子來源的lncRNA的表達水平很低，因此該研究組在擬南芥、水稻和玉米中測定了高深度的轉錄組序列，分別來自每個物種的三個生物學重復，包括66、173、256百萬對雙端測序讀序。該課題組還建立了一個鑒定TE-lincRNA的流程（圖1），其中包括三個關鍵步驟。第一，使用TopHat2將讀序比對到三個物種相應的參考基因組上，并且使用Cufflinks軟件組裝每個物種中的轉錄本。第二，保留長度大于200nt并且與已知基因沒有重疊區域的轉錄本，此外還要刪除那些可能編碼多肽或者蛋白的轉錄本，包括與SWISSPROT數據庫中序列相似的轉錄本，和內部開放閱讀框（ORF）大于100aa或者尾部開放閱讀框大于50aa的轉錄本。通過這步篩選，擬南芥、水稻和玉米中分別還有205、1229、773個轉錄本（也就是lincRNA）符合要求（表1）。第三，部分與TE位點重合但是不完全在TE位點內的lincRNA就是TE-lincRNA。最后，該課題組在擬南芥、水稻和玉米中分別鑒定到47、611和398個TE-lincRNA（表1）。水稻和玉米中的TE-lincRNA數量比擬南芥中多與各物種基因組上的TE位點數量有關（表1）。
該課題組還比較了TE-lincRNA和不含有TE的lincRNA（也就是non-TE-lincRNA）的基本特征。TE-lincRNA和non-TE-lincRNA在三個物種中的長度分布類似，TE-lincRNA的平均長度顯著長于non-TE-lincRNA，在三個物種中分別是829nt對應773nt（擬南芥，P值0.01347，Wilcoxon秩和檢驗）、1125nt對應834nt（水稻，P值小于2.2e-16，Wilcoxon秩和檢驗）、1343nt對應753nt（玉米，P值小于2.2e-16，Wilcoxon秩和檢驗）。三個物種中的大部分lincRNA，包括TE-lincRNA和non-TE-lincRNA都只有單個外顯子。擬南芥和水稻中TE-lincRNA和non-TE-lincRNA的平均外顯數量沒有顯著差異，而玉米中TE-lincRNA的外顯子數量稍顯著低于non-TE-lincRNA（擬南芥1.6對1.5，P值0.2507；水稻1.6對1.7，P值0.1432；玉米1.3對1.4，P值0.007197；Wilcoxon秩和檢驗）。這些結果揭示TE可能導致了lincRNA轉錄長度的延長，但是在水稻和玉米中并不會增加剪接復雜性。此外，該課題組還通過利用Rfam數據庫評估了TE-lincRNA和non-TE-lincRNA中的RNA基序的分值，發現大多數TE-lincRNA和non-TE-lincRNA都不含有或者只含有一條RNA基序，TE-lincRNA和non-TE-lincRNA的RNA基序數量之間沒有顯著差異。TE-lincRNA和non-TE-lincRNA在蛋白編碼基因的5’或者3’端的5kb區域都顯示出位置分布的偏向性。一些TE-lincRNA和non-TE-lincRNA的表達量與他們鄰近的基因的表達量呈現顯著正相關或者負相關。該課題組根據編碼和非編碼基因的表達量建立了共表達網絡，其中包括含有16320個編碼基因、77個lincRNA（包括12個TE-lincRNA）的21個共表達子網絡。TE-lincRNA在脅迫響應子網絡中與多個編碼基因有很高的表達相關性。
圖1 從RNA-Seq數據中鑒定轉座子相關lincRNA的流程
表1 該研究鑒定的lincRNA匯總
2、TE對lincRNA的貢獻的驗證
植物中的TE主要分成兩類：第一類通過RNA中間體進行轉座（復制和粘貼機制），第二類通過DNA中間體進行轉座（切斷和粘貼機制）。根據序列相似性，這兩類TE還可被分為很多家族，并且每一個TE家族都有它們自己的功能和進化歷史。因此，該課題組研究了不同TE家族對lincRNA的貢獻。在擬南芥中，超過40%的TE-lincRNA含有28個RC/Helitron TE（圖2a）。在水稻中，大多數TE-lincRNA分別含有424個微型反向重復轉座子（MITE）、438個未分類的轉座子和335個未分類的反轉錄轉座子。而在玉米中，對于自交系品種B73中的lincRNA，Gypsy、LTR和Copia反轉錄轉座子是三種最主要的貢獻者（圖2a）。由于不同基因組中不同TE的拷貝數不同，因此該課題組采用富集分析來檢驗不同TE對lincRNA的貢獻的顯著性。結果（圖2b）顯示，擬南芥中的短散布元素（SINE）對lincRNA貢獻最顯著，水稻中貢獻較多的是未分類轉座子、未分類反轉錄轉座子、Ty3-gypsy和著絲粒特異的反轉錄轉座子，玉米中最顯著貢獻的是LTR和長散布元素（LINE）。這些結果表明，在不同植物物種中不同TE家族對lincRNA有不同的貢獻程度。與此研究中用到的兩種作物相比，擬南芥幼苗中的lincRNA更傾向于TE家族的缺失。
圖2 擬南芥、水稻和玉米中lincRNA內部不同TE家族的富集情況
此外，該課題組還發現在水稻和玉米中，大部分lincRNA只含有一個TE，而有些TE-lincRNA可含有多達18甚至43個TE。含有多個TE的TE-lincRNA的長度長于那些只有一個TE的lincRNA。此外，多數lincRNA中TE的含量較高，特別是在玉米中。該課題組還分析了水稻和擬南芥中TE-lincRNA的保守性。結果（圖3）顯示，做保守的原件是基因，最不保守的是TE；相比于TE，TE-lincRNA更加保守；TE-lincRNA和non-TE-lincRNA的保守水平相似。這些結果與先前觀點大體一致，即lncRNA中的TE在進化上受功能或結構限制。
圖3 擬南芥和水稻中TE-lincRNA、non-TE-lincRNA、基因、TE和基因間區的保守性水平
3、擬南芥中TE-lincRNA的表達圖譜
該課題組通過鏈特異性RT-PCR在擬南芥、水稻和玉米的幼苗中驗證TE-lincRNA的表達。他們在擬南芥中選擇了11個候選進行驗證，結果顯示這些候選都表達（圖4a）。同樣在水稻和玉米中，各選的三個候選TE-lincRNA也都被證實表達（圖4bc）。為了評估TE-lincRNA在不同擬南芥組織中的表達水平，該課題組進行了數字PCR實驗。結果顯示，所有的TE-lincRNA在不同組織中表現出不同的表達模式。例如，lincRNA18980在根中高表達但是在花中幾乎不表達；TE-lincRNA3688、TE-lincRNA11344、TE-lincRNA15772在根、花和長角果中都低表達（圖5a）。此外，該課題組還使用公共RNA-Seq數據分析了205個擬南芥lincRNA在不同脅迫處理下的表達模式。與正常生長的環境相比，多數lincRNA，包括TE-lincRNA在5種不同脅迫條件下的表達模式不同（圖5b）。這些結果與先前的研究結果一致，也就是lncRNA的表達呈現組織特異性和時空特性。由于先前研究表明很多lncRNA與基因表達調控相關，因此該課題組還對候選TE-lincRNA和與它們鄰近的基因進行了表達相關性的研究。對于TE-lincRNA15772和TE-lincRNA19433，它們的表達與其鄰近基因的表達沒有相關性；然而TE-lincRNA11344的表達水平與其相鄰基因DPBF2的表達負相關（圖5c），這表明TE-lincRNA11344的可能功能是下調鄰近基因的表達量。
圖4 TE-lincRNA在三個物種中的表達驗證
圖5 TE-lincRNA的表達模式
4、擬南芥TE-lincRNA11195突變體誘導對脫落酸（ABA）的抗性
為了研究TE-lincRNA在脅迫條件下的功能，該課題組在多個TE-lincRNA位點插入T-DNA產生突變體，并且在標準的實驗室條件下進行脫落酸處理后觀察表型。結果顯示，含有LTR的TE-lincRNA11195上兩個獨立位點的T-DNA插入表現出抗脫落酸的表型（圖6）。這兩個T-DNA插入的突變體（11195-1和11195-2）都導致TE-lincRNA11195無法被實驗發現（圖6a）。在沒有外源脫落酸的情況下，11195-1和11195-2突變體的幼苗與野生型相似（圖6b）。然而，添加外源脫落酸之后（20uM ABA），與野生型相比，突變體幼苗表現出顯著增強的抗性（圖6b），包括顯著伸長的主根和不十分顯著增長的地上部分鮮重（圖6c）。此外，該課題組還研究了TE-lincRNA11195在種子萌發方面的作用。lincRNA11195突變體在種子萌發階段對外源脫落酸表現出不敏感，并且在種子萌發后的幼苗發育階段也對脫落酸不敏感。
為了研究TE-lincRNA11195在轉錄調節方面的作用，該課題組使用RT-PCR在野生型和ABA不敏感突變體中評估TE-lincRNA11195的表達量。野生型Col-0中ABA處理12小時后，TE-lincRNA11195的表達量顯著上升。突變體幼苗中的ABA受體PYR1/PYL1/PYL4抑制了TE-lincRNA11195的轉錄。這些結果表明TE-lincRNA11195是相應ABA的。為了更加深入地研究TE-lincRNA11195在非生物脅迫反應方面的功能，該課題組檢測了不同脅迫條件下TE-lincRNA11195的表達量。除了ABA處理，鹽脅迫和低溫脅迫都影響著TE-lincRNA11195的表達量，但是并沒有影響臨近基因的表達量。隨后在種子萌發階段和種子萌發后幼苗發育階段進行鹽處理，發現lincRNA11195突變體中種子發芽率顯著高于野生型，這也說明TE-lincRNA11195與鹽脅迫相關。這些結果都表明，植物中TE-lincRNA11195與非生物脅迫響應相關。
為了鑒定TE-lincRNA11195的潛在靶基因，該課題組對正常和ABA處理的野生型和lincRNA11195突變體植株進行了RNA-Seq，并且使用一般線性模型（GLM）鑒定了ABA處理下野生型和lincRNA11195突變體的差異表達基因。結果發現有8個基因在lincRNA11195突變體中顯著上調，10個基因顯著下調（圖7a）。對100個差異表達基因進行GO富集分析，發現這些基因主要集中在“對水楊酸的刺激響應”（圖7b）。這100個差異表達基因分布在基因組的全部染色體上（圖7c）。為了闡明TE-lincRNA11195的具體功能，進一步的分子分析，例如發現RNA與蛋白互作關系的RIP實驗，是十分需要的。
圖6 擬南芥TE-lincRNA11195與脫落酸響應相關
圖7 擬南芥TE-lincRNA11195突變體的基因差異表達分析
5、ddm1突變體植株中TE-lincRNA的特征
周圍環境的變化可能會引起染色質變化，并且植物中已證實有些lncRNA與生物或者非生物脅迫響應相關。因此，該課題組對ddm1突變體中lincRNA的表達量和染色質狀態進行了研究。染色質重塑因子DDM1的突變能夠改變DNase I超敏（DH）位點的分布，這些位點與RNA聚合酶II綁定位點密切相關。該課題組對生長兩周的ddm1突變體幼苗進行轉錄組測序。結果發現，在ddm1突變體中發現特異的轉錄本，并且也發現了TE-lincRNA和non-TE-lincRNA（圖8a，表1）。ddm1突變體中發現的TE-lincRNA與野生型中發現的差不多，盡管如此ddm1中發現的TE-lincRNA和non-TE-lincRNA相對較多（表1）。該課題組還在ddm1中發現387個特異的lincRNA，其中192個與DH位點重合，這表明這些特異的lincRNA可能是由于染色質狀態改變而產生的。隨后，通過ddm1純合植株與野生型雜交，并且通過交叉雜交F1和F2代產生的雜合子幼苗，對這些特異性lincRNA進行了遺傳研究（圖8b）。有趣的是，這些lincRNA可以在雜合子F1代幼苗中檢測到（圖8c），并且F2代中的表達與DDM1基因型無關（圖8c）。此外，這些ddm1特定的lincRNA在有些ddm1純合子中沒有表達，說明lincRNA的遺傳可能是不符合孟德爾遺傳定律的（non-Mendelian）。
圖8 ddm1突變體植株中lincRNA的特征
Transposable elements (TEs) contribute to stress-related long intergenic noncoding RNAs in plants
The Plant Journal (2017) 90, 133–146
doi: 10.1111/tpj.13481
背景
通過高通量測序技術，非編碼RNA已在植物和動物轉錄組中被廣泛研究。這些非編碼RNA中，越來越多的基因間長非編碼（lincRNA）在多細胞生物中為人所知，但是大部分lincRNA的起源和功能仍有待探索。在許多真核基因組中，轉座子（TE）廣泛分布，通常占植物和動物基因組的大部分，但是TE對lincRNA的貢獻在很大程度上是未知的。主要材料方法
1. 材料與數據擬南芥、水稻和玉米RNA-Seq，包括三個生物學重復（GSE76798）
2. 主要分析流程
（1）全基因組lincRNA的鑒定（具體流程見圖1）；
（2）lincRNA中TE的含量、種類等特征；
（3）擬南芥中TE-lincRNA的表達譜特征；
（4）轉基因驗證TE-lincRNA對非生物脅迫的響應；
（5）ddm1突變體植株中lincRNA的特征。
主要結果
1、三種植物物種中轉座子相關lincRNA（TE-lincRNA）的全基因組鑒定為了系統地鑒定TE-lincRNA，該課題組對三個物種的兩周大幼苗進行了鏈特異性轉錄組測序。由于在人類和小鼠中早已報道反轉錄轉座子來源的lncRNA的表達水平很低，因此該研究組在擬南芥、水稻和玉米中測定了高深度的轉錄組序列，分別來自每個物種的三個生物學重復，包括66、173、256百萬對雙端測序讀序。該課題組還建立了一個鑒定TE-lincRNA的流程（圖1），其中包括三個關鍵步驟。第一，使用TopHat2將讀序比對到三個物種相應的參考基因組上，并且使用Cufflinks軟件組裝每個物種中的轉錄本。第二，保留長度大于200nt并且與已知基因沒有重疊區域的轉錄本，此外還要刪除那些可能編碼多肽或者蛋白的轉錄本，包括與SWISSPROT數據庫中序列相似的轉錄本，和內部開放閱讀框（ORF）大于100aa或者尾部開放閱讀框大于50aa的轉錄本。通過這步篩選，擬南芥、水稻和玉米中分別還有205、1229、773個轉錄本（也就是lincRNA）符合要求（表1）。第三，部分與TE位點重合但是不完全在TE位點內的lincRNA就是TE-lincRNA。最后，該課題組在擬南芥、水稻和玉米中分別鑒定到47、611和398個TE-lincRNA（表1）。水稻和玉米中的TE-lincRNA數量比擬南芥中多與各物種基因組上的TE位點數量有關（表1）。
該課題組還比較了TE-lincRNA和不含有TE的lincRNA（也就是non-TE-lincRNA）的基本特征。TE-lincRNA和non-TE-lincRNA在三個物種中的長度分布類似，TE-lincRNA的平均長度顯著長于non-TE-lincRNA，在三個物種中分別是829nt對應773nt（擬南芥，P值0.01347，Wilcoxon秩和檢驗）、1125nt對應834nt（水稻，P值小于2.2e-16，Wilcoxon秩和檢驗）、1343nt對應753nt（玉米，P值小于2.2e-16，Wilcoxon秩和檢驗）。三個物種中的大部分lincRNA，包括TE-lincRNA和non-TE-lincRNA都只有單個外顯子。擬南芥和水稻中TE-lincRNA和non-TE-lincRNA的平均外顯數量沒有顯著差異，而玉米中TE-lincRNA的外顯子數量稍顯著低于non-TE-lincRNA（擬南芥1.6對1.5，P值0.2507；水稻1.6對1.7，P值0.1432；玉米1.3對1.4，P值0.007197；Wilcoxon秩和檢驗）。這些結果揭示TE可能導致了lincRNA轉錄長度的延長，但是在水稻和玉米中并不會增加剪接復雜性。此外，該課題組還通過利用Rfam數據庫評估了TE-lincRNA和non-TE-lincRNA中的RNA基序的分值，發現大多數TE-lincRNA和non-TE-lincRNA都不含有或者只含有一條RNA基序，TE-lincRNA和non-TE-lincRNA的RNA基序數量之間沒有顯著差異。TE-lincRNA和non-TE-lincRNA在蛋白編碼基因的5’或者3’端的5kb區域都顯示出位置分布的偏向性。一些TE-lincRNA和non-TE-lincRNA的表達量與他們鄰近的基因的表達量呈現顯著正相關或者負相關。該課題組根據編碼和非編碼基因的表達量建立了共表達網絡，其中包括含有16320個編碼基因、77個lincRNA（包括12個TE-lincRNA）的21個共表達子網絡。TE-lincRNA在脅迫響應子網絡中與多個編碼基因有很高的表達相關性。
圖1 從RNA-Seq數據中鑒定轉座子相關lincRNA的流程
表1 該研究鑒定的lincRNA匯總
2、TE對lincRNA的貢獻的驗證
植物中的TE主要分成兩類：第一類通過RNA中間體進行轉座（復制和粘貼機制），第二類通過DNA中間體進行轉座（切斷和粘貼機制）。根據序列相似性，這兩類TE還可被分為很多家族，并且每一個TE家族都有它們自己的功能和進化歷史。因此，該課題組研究了不同TE家族對lincRNA的貢獻。在擬南芥中，超過40%的TE-lincRNA含有28個RC/Helitron TE（圖2a）。在水稻中，大多數TE-lincRNA分別含有424個微型反向重復轉座子（MITE）、438個未分類的轉座子和335個未分類的反轉錄轉座子。而在玉米中，對于自交系品種B73中的lincRNA，Gypsy、LTR和Copia反轉錄轉座子是三種最主要的貢獻者（圖2a）。由于不同基因組中不同TE的拷貝數不同，因此該課題組采用富集分析來檢驗不同TE對lincRNA的貢獻的顯著性。結果（圖2b）顯示，擬南芥中的短散布元素（SINE）對lincRNA貢獻最顯著，水稻中貢獻較多的是未分類轉座子、未分類反轉錄轉座子、Ty3-gypsy和著絲粒特異的反轉錄轉座子，玉米中最顯著貢獻的是LTR和長散布元素（LINE）。這些結果表明，在不同植物物種中不同TE家族對lincRNA有不同的貢獻程度。與此研究中用到的兩種作物相比，擬南芥幼苗中的lincRNA更傾向于TE家族的缺失。
圖2 擬南芥、水稻和玉米中lincRNA內部不同TE家族的富集情況
此外，該課題組還發現在水稻和玉米中，大部分lincRNA只含有一個TE，而有些TE-lincRNA可含有多達18甚至43個TE。含有多個TE的TE-lincRNA的長度長于那些只有一個TE的lincRNA。此外，多數lincRNA中TE的含量較高，特別是在玉米中。該課題組還分析了水稻和擬南芥中TE-lincRNA的保守性。結果（圖3）顯示，做保守的原件是基因，最不保守的是TE；相比于TE，TE-lincRNA更加保守；TE-lincRNA和non-TE-lincRNA的保守水平相似。這些結果與先前觀點大體一致，即lncRNA中的TE在進化上受功能或結構限制。
圖3 擬南芥和水稻中TE-lincRNA、non-TE-lincRNA、基因、TE和基因間區的保守性水平
3、擬南芥中TE-lincRNA的表達圖譜
該課題組通過鏈特異性RT-PCR在擬南芥、水稻和玉米的幼苗中驗證TE-lincRNA的表達。他們在擬南芥中選擇了11個候選進行驗證，結果顯示這些候選都表達（圖4a）。同樣在水稻和玉米中，各選的三個候選TE-lincRNA也都被證實表達（圖4bc）。為了評估TE-lincRNA在不同擬南芥組織中的表達水平，該課題組進行了數字PCR實驗。結果顯示，所有的TE-lincRNA在不同組織中表現出不同的表達模式。例如，lincRNA18980在根中高表達但是在花中幾乎不表達；TE-lincRNA3688、TE-lincRNA11344、TE-lincRNA15772在根、花和長角果中都低表達（圖5a）。此外，該課題組還使用公共RNA-Seq數據分析了205個擬南芥lincRNA在不同脅迫處理下的表達模式。與正常生長的環境相比，多數lincRNA，包括TE-lincRNA在5種不同脅迫條件下的表達模式不同（圖5b）。這些結果與先前的研究結果一致，也就是lncRNA的表達呈現組織特異性和時空特性。由于先前研究表明很多lncRNA與基因表達調控相關，因此該課題組還對候選TE-lincRNA和與它們鄰近的基因進行了表達相關性的研究。對于TE-lincRNA15772和TE-lincRNA19433，它們的表達與其鄰近基因的表達沒有相關性；然而TE-lincRNA11344的表達水平與其相鄰基因DPBF2的表達負相關（圖5c），這表明TE-lincRNA11344的可能功能是下調鄰近基因的表達量。
圖4 TE-lincRNA在三個物種中的表達驗證
圖5 TE-lincRNA的表達模式
4、擬南芥TE-lincRNA11195突變體誘導對脫落酸（ABA）的抗性
為了研究TE-lincRNA在脅迫條件下的功能，該課題組在多個TE-lincRNA位點插入T-DNA產生突變體，并且在標準的實驗室條件下進行脫落酸處理后觀察表型。結果顯示，含有LTR的TE-lincRNA11195上兩個獨立位點的T-DNA插入表現出抗脫落酸的表型（圖6）。這兩個T-DNA插入的突變體（11195-1和11195-2）都導致TE-lincRNA11195無法被實驗發現（圖6a）。在沒有外源脫落酸的情況下，11195-1和11195-2突變體的幼苗與野生型相似（圖6b）。然而，添加外源脫落酸之后（20uM ABA），與野生型相比，突變體幼苗表現出顯著增強的抗性（圖6b），包括顯著伸長的主根和不十分顯著增長的地上部分鮮重（圖6c）。此外，該課題組還研究了TE-lincRNA11195在種子萌發方面的作用。lincRNA11195突變體在種子萌發階段對外源脫落酸表現出不敏感，并且在種子萌發后的幼苗發育階段也對脫落酸不敏感。
為了研究TE-lincRNA11195在轉錄調節方面的作用，該課題組使用RT-PCR在野生型和ABA不敏感突變體中評估TE-lincRNA11195的表達量。野生型Col-0中ABA處理12小時后，TE-lincRNA11195的表達量顯著上升。突變體幼苗中的ABA受體PYR1/PYL1/PYL4抑制了TE-lincRNA11195的轉錄。這些結果表明TE-lincRNA11195是相應ABA的。為了更加深入地研究TE-lincRNA11195在非生物脅迫反應方面的功能，該課題組檢測了不同脅迫條件下TE-lincRNA11195的表達量。除了ABA處理，鹽脅迫和低溫脅迫都影響著TE-lincRNA11195的表達量，但是并沒有影響臨近基因的表達量。隨后在種子萌發階段和種子萌發后幼苗發育階段進行鹽處理，發現lincRNA11195突變體中種子發芽率顯著高于野生型，這也說明TE-lincRNA11195與鹽脅迫相關。這些結果都表明，植物中TE-lincRNA11195與非生物脅迫響應相關。
為了鑒定TE-lincRNA11195的潛在靶基因，該課題組對正常和ABA處理的野生型和lincRNA11195突變體植株進行了RNA-Seq，并且使用一般線性模型（GLM）鑒定了ABA處理下野生型和lincRNA11195突變體的差異表達基因。結果發現有8個基因在lincRNA11195突變體中顯著上調，10個基因顯著下調（圖7a）。對100個差異表達基因進行GO富集分析，發現這些基因主要集中在“對水楊酸的刺激響應”（圖7b）。這100個差異表達基因分布在基因組的全部染色體上（圖7c）。為了闡明TE-lincRNA11195的具體功能，進一步的分子分析，例如發現RNA與蛋白互作關系的RIP實驗，是十分需要的。
圖6 擬南芥TE-lincRNA11195與脫落酸響應相關
圖7 擬南芥TE-lincRNA11195突變體的基因差異表達分析
5、ddm1突變體植株中TE-lincRNA的特征
周圍環境的變化可能會引起染色質變化，并且植物中已證實有些lncRNA與生物或者非生物脅迫響應相關。因此，該課題組對ddm1突變體中lincRNA的表達量和染色質狀態進行了研究。染色質重塑因子DDM1的突變能夠改變DNase I超敏（DH）位點的分布，這些位點與RNA聚合酶II綁定位點密切相關。該課題組對生長兩周的ddm1突變體幼苗進行轉錄組測序。結果發現，在ddm1突變體中發現特異的轉錄本，并且也發現了TE-lincRNA和non-TE-lincRNA（圖8a，表1）。ddm1突變體中發現的TE-lincRNA與野生型中發現的差不多，盡管如此ddm1中發現的TE-lincRNA和non-TE-lincRNA相對較多（表1）。該課題組還在ddm1中發現387個特異的lincRNA，其中192個與DH位點重合，這表明這些特異的lincRNA可能是由于染色質狀態改變而產生的。隨后，通過ddm1純合植株與野生型雜交，并且通過交叉雜交F1和F2代產生的雜合子幼苗，對這些特異性lincRNA進行了遺傳研究（圖8b）。有趣的是，這些lincRNA可以在雜合子F1代幼苗中檢測到（圖8c），并且F2代中的表達與DDM1基因型無關（圖8c）。此外，這些ddm1特定的lincRNA在有些ddm1純合子中沒有表達，說明lincRNA的遺傳可能是不符合孟德爾遺傳定律的（non-Mendelian）。
圖8 ddm1突變體植株中lincRNA的特征
小結
通過使用鏈特異性RNA測序，該課題組在擬南芥、水稻和玉米中分析了lincRNA的表達模式，分別鑒定了47、611和398個與TE相關的lincRNA（TE-lincRNA）。與DNA轉座子相比，TE-lincRNA更常來自反轉錄轉座子。由于水稻和玉米基因組中的反轉錄轉座子拷貝數都很多，因此TE-lincRNA的數量也很多。該課題組通過鏈特異性RT-PCR驗證了這些TE-lincRNA的表達，并且在鹽、脫落酸和低溫處理后發現這些TE-lincRNA的組織特異性和應激響應。對于擬南芥TE-lincRNA11195，突變體對ABA的敏感性降低，與野生型相比，突變體具有較長的根和較高的地上部分鮮重。最后，通過改變擬南芥染色質重塑突變體ddm1中的染色質狀態，特異性lincRNA，包括TE-lincRNA，能夠在前述的未轉錄區域轉錄并且在后代中遺傳。該課題組的研究結果不僅證明了TE相關lincRNA在植物非生物脅迫反應中起重要作用，還發現lincRNA和TE-lincRNA可能能夠作為真核生物中的適應性庫。- 服務熱線
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