lncRNA測序案例解讀-醫學
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乳腺癌lncRNA的研究揭示了DSCAM-AS1在乳腺癌發展中的作用
The lncRNA landscape of breast cancer reveals a role for DSCAM-AS1 in breast cancer progression
DOI: 10.1038/ncomms12791
基于指定的內分泌療法（有效的抗雌激素），雌激素受體（ER）陽性乳腺癌患者的預后比ER陰性乳腺癌患者的預后更好。然而，盡管內分泌療法有功效，大多數乳腺癌死亡病例發生在ER陽性乳腺癌患者身上，因為ER陽性比陰性疾病的發病率要高得多（大約80%比20%），而且有相當一部分女性患有先天或后天的內分泌治療耐藥性疾病。
綜上所述，我們迫切地需要了解ER驅動的乳腺癌生物學以及它們抵抗內分泌治療的機制。ER介導的癌癥發生和進展的機制是一個激烈的科學研究領域，但現在仍不完全清楚。在這方面，雖然大量的研究集中于ER異常，如ER（ESR1） 的基因編碼突變，以及可能介導耐藥性的共存激活通路，如HER2，但是很少有研究對ER調控的非編碼RNA進行研究。因此，該課題組開始對乳腺癌中由雌激素驅動的lncRNA進行全面的探索和研究。
947個乳腺樣本的RNA-seq數據。本研究涉及到的RNA-seq數據可在NCBI的SRA數據庫（SRP078392）下載， ChIP-seq數據可以在GEO數據庫（GSE32222）下載。
2. 主要分析流程
（1）雌激素受體（ER）和乳腺癌相關的lncRNA的鑒定和差異表達分析（SSEA軟件）。根據lncRNA的表達量進行聚類分析。依據預測的ER在lncRNA啟動子區域的綁定位點，以及高表達量的條件來篩選lncRNA，最終選擇DSCAM-AS1這個lncRNA來做后續的分析和研究。
（2）利用ER染色質免疫沉淀反應測序（ChIP-seq）證實ER與DSCAM-AS1的綁定關系，揭示DSCAM-AS1 的特征。
（3）多種實驗和分析（敲除和過表達實驗、體外RNA結合實驗、質譜、RNA免疫共沉淀、細胞侵襲實驗、抗體和免疫印跡分析實驗、染色質免疫沉淀實驗、ChIP-seq測序分析、潛在編碼蛋白分析、腫瘤臨床特征相關性分析、TCGA乳腺數據生存分析、基因集合富集分析、計算機預測lncRNA上的蛋白綁定位點、RACE實驗、單分子熒光原位雜交實驗等）揭示DSCAM-AS1 的功能和作用機制。
利用RNA-Seq非參數差異表達分析工具（Sample Set Enrichment Analysis，SSEA），研究人員關注的是那些與良性相鄰組織差異表達的lncRNA。通過低表達量篩選，研究人員鑒定到437個乳腺癌中差異表達的lncRNA。根據表達量對來自不同乳腺癌亞型的lncRNA進行聚類發現，來自PAM50亞型的lncRNA與其他lncRNA表現完全不同（圖1a），這可能說明了來自PAM50亞型的lncRNA有著與其他lncRNA不同的生物學作用機制?；趌ncRNA表達量不能區分雌激素受體引起（ER-driven）的管腔A亞型和管腔B亞型，但是卻能夠很好地區分管腔型乳腺癌與HER2型、基底樣型、正常乳腺樣型（圖1a）。除了能夠區分乳腺癌的臨床亞型，鑒定到的lncRNA也可以分成三個明顯的簇。第一個簇（圖1a‘Luminal’）中包含的lncRNA在管腔A亞型和管腔B亞型樣本中過表達，但是在其他亞型或者正常樣本中低表達。第二個簇（圖1a‘Upregulated’）中包含的lncRNA在所有乳腺癌樣本中都表達上調，并且這個簇里面包括一個已知的乳腺癌lncRNA，即HOTAIR。第三個簇（圖1a‘Downregulated’）中包含的lncRNA在乳腺癌樣本中下調。綜上推測管腔內聚集的lncRNA可能與雌激素響應相關。
通過利用947個乳腺癌RNA-Seq樣本，該課題組鑒定到了在雌激素受體陽性（ER-positive）和雌激素受體陰性（ER-negative）乳腺癌樣本中差異表達的lncRNA（圖1b）。正如所預期的，在雌激素受體陽性樣本中差異表達的lncRNA，通過聚類能夠很好地區分管腔型和HER2型、基底樣型（圖1b）。有趣的是，有一些在雌激素受體陽性樣本中表達下調的lncRNA卻能在基底樣型中表達上調（圖1b‘Basal lncRNAs’）。由于基底樣型乳腺癌中已知的驅動基因很少，并且基底樣型乳腺癌在臨床上是最具有侵略性的，這些在基底樣型乳腺癌中特異表達的lncRNA對以后基底樣型乳腺癌的生物學研究具有重要意義。
通過篩選相對正常組織在癌癥中上調的（圖1a）、相對雌激素受體陰性在雌激素受體陽性樣本中上調的（圖1b）lncRNA，該課題組著手探究可能致癌的與雌激素受體調節相關的lncRNA。研究發現由63個lncRNA符合上述要求（圖1c）。為了研究那些在生物學和臨床上最有意義的lncRNA，該課題組主要關注那些在乳腺癌組織中特別高表達的、直接受雌激素受體調節的（根據ER是否綁定在目標基因的啟動子區域）、在乳腺癌細胞中雌激素刺激誘導響應水平高的lncRNA（圖1c）。通過這樣的選擇條件，該課題組選擇DSCAM-AS1進行后續研究。因為DSCAM-AS1在乳腺癌組織中特別高表達、啟動子區域含有ER綁定位點、在MCF7和T47D細胞系中表現出最強的雌激素誘導響應水平。
圖1 雌激素受體（ER）和乳腺癌相關的lncRNA的鑒定。
2、DSCAM-AS1的特征
DSCAM-AS1最先被報道的是與一個管腔型乳腺癌細胞系的擴散相關，它在乳腺癌和肺癌中表現出高度地癌癥特異性的表達模式（圖2a，轉錄組測序數據來自TCGA和Michigan Center for Translation Pathology的6503個癌癥和正常組織和細胞系）。在乳腺癌樣本中，DSCAM-AS1在ER陽性腫瘤樣本中表達高度富集（t檢驗，P值＜10e-5）（圖2b）。此外，對50個乳腺癌細胞系的RNA-Seq分析發現，DSCAM-AS1的表達對ER陽性細胞系有很高的特異性（圖2c）。MCF7和T47D細胞系中的ER染色質免疫沉淀反應測序（ChIP-seq）發現，雌激素刺激后ER綁定到DSCAM-AS1的啟動子區域（圖2d），這個結果也被DSCAM-AS1的啟動子區域的ChIP-qPCR實驗所證實，這進一步說明了ER與DSCAM-AS1相關。在雌激素刺激后，MCF7和T47D細胞系中都誘導了DSCAM-AS1的表達，這種誘導隨著三苯氧胺（tamoxifen）的加入而逆轉，這證實了ER實際上調節DSCAM-AS1的表達（圖2e）。已知與ER調節相關的蛋白編碼基因GREB1和PGR在雌激素響應下也與DSCAM-AS1的表達模式相同，但是MALAT1（lncRNA）作為陰性對照，其表達量不能被雌激素所誘導（圖2e）。
圖2 DSCAM-AS1的特征。
3、DSCAM-AS1與癌癥侵襲相關
該課題組隨后研究了DSCAM-AS1的臨床相關性。由于DSCAM-AS1是一個lncRNA，它的表達量并不是通過傳統的基因芯片來計算。因此該課題組選用一種叫做guilt-by-association的分析方法，通過與DSCAM-AS1最相關的編碼基因來研究其臨床相關性。由于DSCAM-AS1是一個ER調節相關的lncRNA，實驗僅在ER陽性乳腺癌樣本中進行，因為在這些樣本中DSCAM-AS1被富集并且最具有臨床相關性。該課題組是用了來自Oncomine的乳腺癌臨床數據集，包括與癌癥、臨床分級、復發、存活和轉移等相關的基因表達數據集。該課題組評估了那些與DSCAM-AS1最正相關和負相關的基因。與DSCAM-AS1正相關的基因與包括癌癥侵襲性增加、三苯氧胺耐藥性、臨床分級高、癌癥轉移等臨床特征顯著相關（圖3ab）。類似地，與DSCAM-AS1負相關的基因預示著更有利的臨床結果。對于大多數臨床特征，DSCAM-AS1正相關的基因表現出與那些與EZH2最相關的基因類似的臨床相關性，EZH2是一種已知的乳腺癌臨床侵襲性相關的基因標記（圖3b）。此外，對與DSCAM-AS1相關的所有基因進行基因集富集分析發現，這些基因與大量基因特征（例如乳腺癌發生、癌癥侵襲性、ER和三苯氧胺相關）顯著相關。雖然ER陽性乳腺癌通常導致更好的臨床結果，但在管腔型乳腺癌中，DSCAM-AS1在管腔B亞型中顯著高表達，而管腔B亞型乳腺癌是一種最具有臨床侵襲性的ER陽性乳腺癌臨床亞型（圖3c）。以上這些都說明了DSCAM-AS1與臨床侵襲性相關，但是在對來自TCGA的ER陽性乳腺樣本的生存分析中發現，DSCAM-AS1的表達并不是與臨床結果顯著相關。然而，對生存的明確評估可能需要對TCGA乳腺樣本進行更有力和更長期的臨床治療。
該課題組隨后研究了DSCAM-AS1在ER陽性乳腺癌細胞系中的致癌作用。在MCF7和T47D細胞系中，使用shRNA方法，DSCAM-AS1能夠被穩定敲除。DSCAM-AS1敲除后兩種細胞系的增殖能力都降低了（圖3d），侵襲能力也降低（圖3e），因此這些細胞也基本上無法在軟瓊脂中形成菌落（圖3f）。由于ER調節DSCAM-AS1的水平、ER的表達量和蛋白水平都不依賴于DSCAM-AS1的表達水平，因此排除了ER水平的改變而導致這種現象的可能性。此外，敲除DSCAM-AS1并沒有影響DSCAM基因的轉錄和翻譯水平，因為DSCAM-AS1在反義鏈和內含子區域。為了進一步證明DSCAM-AS1對侵襲性癌癥表型的影響，該課題組在T47D和ZR75-1細胞系中過表達DSCAM-AS1，這兩個細胞系是ER陽性乳腺癌細胞系，并且中度表達DSCAM-AS1（圖2c）。過表達實驗發現侵襲表型的增加（圖3g）。沒有選用MCF7細胞系來做過表達研究是因為DSCAM-AS1在該細胞系中已經有很高水平的表達量（圖2c）。過表達實驗也在MDA-MB-231細胞系中進行，這是一種常見的ER陰性細胞系。然而，外源DSCAM-AS1無法通過擴散和入侵致癌。這個現象可能是因為ER陽性細胞提供的必需的遺傳和表觀遺傳環境才可以使DSCAM-AS1具有侵襲性，該作用機制的闡明需要更多研究。此外，僅僅DSCAM-AS1并不能使細胞具有高度侵襲性。為了進一步調查DSCAM-AS1對癌癥表型的影響，該課題組進行了一次小鼠異種移植腫瘤生長測定，結果表明DSCAM-AS1的缺失能夠減少體內植入的T47D細胞的生長（圖3h）。敲除DSCAM-AS1后，植入細胞的轉移潛能也降低了（圖3i）。
圖3 DSCAM-AS1與癌癥侵襲相關。
4、hnRNPL在DSCAM-AS1機制中的作用
已有報道稱lncRNA通過與RNA、DNA或者蛋白綁定而行駛功能。因此，通過鑒定DSCAM-AS1的互作蛋白可以研究該lncRNA的致癌機制。為了鑒定DSCAM-AS1的互作蛋白，該課題組進行了pull-down實驗，并且對pull-down下來的產物進行質譜以確定與DSCAM-AS1綁定的蛋白（圖4a）。結果顯示，hnRNPL具有最高的光譜計數（圖4b），并且與hnRNPL形成復合體的蛋白PCBP2也具有相當高的光譜計數。因此接下來該課題組進一步探究DSCAM-AS1與hnRNPL的互作關系。hnRNPL是一種在多個組織中表達的蛋白，并且與調節RNA穩定性和影響基因表達相關。DSCAM-AS1與hnRNPL的綁定關系不僅僅在pull-down實驗中驗證，也在western-blot實驗中得到驗證（圖4c）。然而其他RNA結合蛋白并沒有綁定到DSCAM-AS1上，這說明DSCAM-AS1通常不會與RNA結合蛋白混雜結合（圖4c）。為了進一步證實這種綁定關系和特異性，該課題組使用針對hnRNPL的抗體進行了RNA免疫沉淀反應（RIP）。結果顯示，在MCF7和T47D細胞系中抗hnRNPL免疫共沉淀反應都大量富集了DSCAM-AS1，而對照組中幾乎無富集（圖4d）。此外，抗snRNP70和抗HuR免疫共沉淀反應都沒有pull-down下來DSCAM-AS1，這些結果說明了DSCAM-AS1與hnRNPL的綁定的特異性。
為了更具體地研究DSCAM-AS1和hnRNPL的功能，該課題組評估了敲除hnRNPL對過表達DSCAM-AS1產生的侵襲性的影響。結果顯示，降低hnRNPL的水平完全逆轉了過表達DSCAM-AS1產生的侵襲性（圖4e）。因為在對照細胞系中敲除hnRNPL只輕微地降低了侵襲性，而在過表達DSCAM-AS1細胞系中觀察到的侵襲明顯減少，這可能是由于hnRNPL影響了DSCAM-AS1獨有的侵襲機制。因此，為了進一步探究DSCAM-AS1和hnRNPL之間的功能關系，該課題組著手研究兩者之間的綁定位點。根據之前hnRNPL交聯-免疫沉淀測序（CLIP-seq）的研究，計算機預測DSCAM-AS1的綁定位點在3’端附近（圖4f）。研究報道hnRNPL綁定在富含CACA堿基的RNA位點，而預測的綁定區域有10個堿基對的CACA伸展。為了證明這個預測的區域是否真的綁定hnRNPL，該課題組構建了多個包含或者不包含綁定位點的突變體。DSCAM-AS1-5和DSCAM-AS1-3是大型缺失突變體，僅含有5’端和3’端，只有DSCAM-AS1-3突變體含有預測的綁定位點，DSCAM-AS1-D突變體在預測的綁定位點有27個核苷酸的刪除（圖4f,g）。這些突變體在HEK293細胞系中表達，因為該細胞系缺少內源性DSCAM-AS1的表達，但是仍然表達hnRNPL。結果顯示，通過pull-down實驗和western-blot實驗，預測的綁定位點的缺失能夠有效地消除hnRNPL蛋白的綁定（圖4g）。RNA二級結構是RNA功能性的重要組成部分，是RNA-蛋白質相互作用的關鍵因素。由于DSCAM-AS1-D突變體在預測的綁定位點的27個核苷酸的刪除是轉錄本的很小一部分，為了證明這個小片段刪除不會引起RNA二級結構的顯著變化，該課題組利用RNAfold結構預測軟件調查了該片段的刪除對RNA二級結構的影響。根據最小自由能預測，DSCAM-AS1和DSCAM-AS1-D的假定二級結構大體相似，說明hnRNPL未能綁定到DSCAM-AS1-D突變體并不是由于二級結構的變化。有趣的是，在T47D細胞系中過表達DSCAM-AS1-D突變體未能重演過表達DSCAM-AS1時觀察到的侵襲性增加（圖4h）。以上這些結果都證實在這些ER陽性乳腺癌細胞中，DSCAM-AS1通過與hnRNPL的相互作用來促進致癌性。
圖4 DSCAM-AS1和hnRNPL的功能關系。
5、DSCAM-AS1在三苯氧胺耐藥中的作用
存在一定數量的ER陽性乳腺癌患者對內分泌治療產生耐藥性，并且在臨床上表現出癌癥復發和轉移。因此，由于DSCAM-AS1與預后不良的ER陽性乳腺癌相關，該課題組著手研究DSCAM-AS1在推翻雌激素療法依賴性和促進抗雌激素療法方面的潛在功能。該課題組在1uM三苯氧胺中傳代MCF7細胞6個月，直到獲得能夠在三苯氧胺中生長的MCF7細胞的亞群，這些細胞被稱為三苯氧胺抗性MCF7細胞（TamR-MCF7）。有趣的是，雖然ER的靶標基因（GREB1和PGR）的表達量相對于親本MCF7細胞降低，但是盡管DSCAM-AS1已經在MCF7細胞中表達水平很高，其表達量仍顯著上升（圖5a）。ER水平也上升，這可能更像是作為對三苯氧胺的抗雌激素作用的持續反應的一種補償性上調。此外，三苯氧胺對親代MCF7細胞的短時間處理，8小時后使DSCAM-AS1水平降低，24小時后恢復到處理前的水平。相比之下，ER的靶標基因GREB1在短時間和長時間處理下都表現出明顯的表達減少。為了研究DSCAM-AS1在TamR-MCF7細胞中表達上調是否與其功能相關，該課題組評估了敲除DSCAM-AS1后的細胞增殖能力。在TamR-MCF7細胞中敲除DSCAM-AS1，將這些細胞在1uM三苯氧胺中培養，發現其增殖能力降低，與親代MCF7細胞在1uM三苯氧胺中培養的增殖能力水平差不多（圖5b）。此外，在這些細胞中敲除hnRNPL，與在TamR-MCF7細胞中增殖能力的缺失水平差不多，這表明DSCAM-AS1和hnRNPL可能都在促進三苯氧胺抗藥性的發展方面起到作用。
該課題組還調查了在T47D細胞系中過表達DSCAM-AS1后DSCAM-AS1傳遞三苯氧胺抗藥性的能力。過表達DSCAM-AS1 與三苯氧胺抗藥性的增長呈現劑量依賴性相關，在三苯氧胺含量低至100nM時，細胞活力顯著增加（圖5c）。此外，過表達DSCAM-AS1 的細胞在雌激素缺乏的培養基中表現出增殖優勢。這種增殖優勢在添加雌激素后消失，并且在添加三苯氧胺后又重新獲得。恰恰相反，該該課題組發現在T47D細胞中敲除DSCAM-AS1會導致雌激素依賴性增強。
為了證實這些體外實驗的發現，該課題組在原發和轉移的乳腺癌組織中產生了ER的ChIP-seq數據。這些腫瘤組織被分為以下幾組：ER陰性原發腫瘤、ER陽性原發并且三苯氧胺響應、ER陽性原發并且三苯氧胺不響應、ER陽性轉移腫瘤。引人注目的是，對DSCAM-AS1啟動子的研究表明，在具有臨床侵襲性的腫瘤中ER優先與DSCAM-AS1啟動子結合（圖5d），而ER的靶標基因GREB1幾乎在所有ER陽性腫瘤中都有ER在其啟動子區域綁定，并沒有在在具有臨床侵襲性的腫瘤中表現出傾向性?？傊?，這些數據表明了DSCAM-AS1的表達與具有臨床侵襲性ER陽性的乳腺癌樣本之間的聯系，這種聯系可以部分解釋為，DSCAM-AS1具有促進雌激素依賴性的致癌性，從而潛在地促進了使用三苯氧胺進行內分泌治療的耐藥性。
圖5 DSCAM-AS1與三苯氧胺耐藥性相關。
The lncRNA landscape of breast cancer reveals a role for DSCAM-AS1 in breast cancer progression
DOI: 10.1038/ncomms12791
背景
最近研究表明，lncRNA與多種生物過程相關，包括致癌性和腫瘤生長。為了研究乳腺癌中的lncRNA，該課題組計算了來自947個乳腺樣本的RNA-seq數據中lncRNA的表達量。此前，該課題組在6,503個RNA-seq數據中大規模鑒定了約45,000個未注釋的人類lncRNA，這些數據將會被用到這個研究中?；谙惹霸谌橄侔﹍ncRNA方面的工作，該課題組將對乳腺癌各組織RNA-seq數據進行全面分析，并且確定能與乳腺癌有關的lncRNA。基于指定的內分泌療法（有效的抗雌激素），雌激素受體（ER）陽性乳腺癌患者的預后比ER陰性乳腺癌患者的預后更好。然而，盡管內分泌療法有功效，大多數乳腺癌死亡病例發生在ER陽性乳腺癌患者身上，因為ER陽性比陰性疾病的發病率要高得多（大約80%比20%），而且有相當一部分女性患有先天或后天的內分泌治療耐藥性疾病。
綜上所述，我們迫切地需要了解ER驅動的乳腺癌生物學以及它們抵抗內分泌治療的機制。ER介導的癌癥發生和進展的機制是一個激烈的科學研究領域，但現在仍不完全清楚。在這方面，雖然大量的研究集中于ER異常，如ER（ESR1） 的基因編碼突變，以及可能介導耐藥性的共存激活通路，如HER2，但是很少有研究對ER調控的非編碼RNA進行研究。因此，該課題組開始對乳腺癌中由雌激素驅動的lncRNA進行全面的探索和研究。
主要材料方法
1. 材料與數據947個乳腺樣本的RNA-seq數據。本研究涉及到的RNA-seq數據可在NCBI的SRA數據庫（SRP078392）下載， ChIP-seq數據可以在GEO數據庫（GSE32222）下載。
2. 主要分析流程
（1）雌激素受體（ER）和乳腺癌相關的lncRNA的鑒定和差異表達分析（SSEA軟件）。根據lncRNA的表達量進行聚類分析。依據預測的ER在lncRNA啟動子區域的綁定位點，以及高表達量的條件來篩選lncRNA，最終選擇DSCAM-AS1這個lncRNA來做后續的分析和研究。
（2）利用ER染色質免疫沉淀反應測序（ChIP-seq）證實ER與DSCAM-AS1的綁定關系，揭示DSCAM-AS1 的特征。
（3）多種實驗和分析（敲除和過表達實驗、體外RNA結合實驗、質譜、RNA免疫共沉淀、細胞侵襲實驗、抗體和免疫印跡分析實驗、染色質免疫沉淀實驗、ChIP-seq測序分析、潛在編碼蛋白分析、腫瘤臨床特征相關性分析、TCGA乳腺數據生存分析、基因集合富集分析、計算機預測lncRNA上的蛋白綁定位點、RACE實驗、單分子熒光原位雜交實驗等）揭示DSCAM-AS1 的功能和作用機制。
主要結果
1、雌激素受體（ER）和乳腺癌相關的lncRNA的鑒定利用RNA-Seq非參數差異表達分析工具（Sample Set Enrichment Analysis，SSEA），研究人員關注的是那些與良性相鄰組織差異表達的lncRNA。通過低表達量篩選，研究人員鑒定到437個乳腺癌中差異表達的lncRNA。根據表達量對來自不同乳腺癌亞型的lncRNA進行聚類發現，來自PAM50亞型的lncRNA與其他lncRNA表現完全不同（圖1a），這可能說明了來自PAM50亞型的lncRNA有著與其他lncRNA不同的生物學作用機制?；趌ncRNA表達量不能區分雌激素受體引起（ER-driven）的管腔A亞型和管腔B亞型，但是卻能夠很好地區分管腔型乳腺癌與HER2型、基底樣型、正常乳腺樣型（圖1a）。除了能夠區分乳腺癌的臨床亞型，鑒定到的lncRNA也可以分成三個明顯的簇。第一個簇（圖1a‘Luminal’）中包含的lncRNA在管腔A亞型和管腔B亞型樣本中過表達，但是在其他亞型或者正常樣本中低表達。第二個簇（圖1a‘Upregulated’）中包含的lncRNA在所有乳腺癌樣本中都表達上調，并且這個簇里面包括一個已知的乳腺癌lncRNA，即HOTAIR。第三個簇（圖1a‘Downregulated’）中包含的lncRNA在乳腺癌樣本中下調。綜上推測管腔內聚集的lncRNA可能與雌激素響應相關。
通過利用947個乳腺癌RNA-Seq樣本，該課題組鑒定到了在雌激素受體陽性（ER-positive）和雌激素受體陰性（ER-negative）乳腺癌樣本中差異表達的lncRNA（圖1b）。正如所預期的，在雌激素受體陽性樣本中差異表達的lncRNA，通過聚類能夠很好地區分管腔型和HER2型、基底樣型（圖1b）。有趣的是，有一些在雌激素受體陽性樣本中表達下調的lncRNA卻能在基底樣型中表達上調（圖1b‘Basal lncRNAs’）。由于基底樣型乳腺癌中已知的驅動基因很少，并且基底樣型乳腺癌在臨床上是最具有侵略性的，這些在基底樣型乳腺癌中特異表達的lncRNA對以后基底樣型乳腺癌的生物學研究具有重要意義。
通過篩選相對正常組織在癌癥中上調的（圖1a）、相對雌激素受體陰性在雌激素受體陽性樣本中上調的（圖1b）lncRNA，該課題組著手探究可能致癌的與雌激素受體調節相關的lncRNA。研究發現由63個lncRNA符合上述要求（圖1c）。為了研究那些在生物學和臨床上最有意義的lncRNA，該課題組主要關注那些在乳腺癌組織中特別高表達的、直接受雌激素受體調節的（根據ER是否綁定在目標基因的啟動子區域）、在乳腺癌細胞中雌激素刺激誘導響應水平高的lncRNA（圖1c）。通過這樣的選擇條件，該課題組選擇DSCAM-AS1進行后續研究。因為DSCAM-AS1在乳腺癌組織中特別高表達、啟動子區域含有ER綁定位點、在MCF7和T47D細胞系中表現出最強的雌激素誘導響應水平。
圖1 雌激素受體（ER）和乳腺癌相關的lncRNA的鑒定。
2、DSCAM-AS1的特征
DSCAM-AS1最先被報道的是與一個管腔型乳腺癌細胞系的擴散相關，它在乳腺癌和肺癌中表現出高度地癌癥特異性的表達模式（圖2a，轉錄組測序數據來自TCGA和Michigan Center for Translation Pathology的6503個癌癥和正常組織和細胞系）。在乳腺癌樣本中，DSCAM-AS1在ER陽性腫瘤樣本中表達高度富集（t檢驗，P值＜10e-5）（圖2b）。此外，對50個乳腺癌細胞系的RNA-Seq分析發現，DSCAM-AS1的表達對ER陽性細胞系有很高的特異性（圖2c）。MCF7和T47D細胞系中的ER染色質免疫沉淀反應測序（ChIP-seq）發現，雌激素刺激后ER綁定到DSCAM-AS1的啟動子區域（圖2d），這個結果也被DSCAM-AS1的啟動子區域的ChIP-qPCR實驗所證實，這進一步說明了ER與DSCAM-AS1相關。在雌激素刺激后，MCF7和T47D細胞系中都誘導了DSCAM-AS1的表達，這種誘導隨著三苯氧胺（tamoxifen）的加入而逆轉，這證實了ER實際上調節DSCAM-AS1的表達（圖2e）。已知與ER調節相關的蛋白編碼基因GREB1和PGR在雌激素響應下也與DSCAM-AS1的表達模式相同，但是MALAT1（lncRNA）作為陰性對照，其表達量不能被雌激素所誘導（圖2e）。
圖2 DSCAM-AS1的特征。
3、DSCAM-AS1與癌癥侵襲相關
該課題組隨后研究了DSCAM-AS1的臨床相關性。由于DSCAM-AS1是一個lncRNA，它的表達量并不是通過傳統的基因芯片來計算。因此該課題組選用一種叫做guilt-by-association的分析方法，通過與DSCAM-AS1最相關的編碼基因來研究其臨床相關性。由于DSCAM-AS1是一個ER調節相關的lncRNA，實驗僅在ER陽性乳腺癌樣本中進行，因為在這些樣本中DSCAM-AS1被富集并且最具有臨床相關性。該課題組是用了來自Oncomine的乳腺癌臨床數據集，包括與癌癥、臨床分級、復發、存活和轉移等相關的基因表達數據集。該課題組評估了那些與DSCAM-AS1最正相關和負相關的基因。與DSCAM-AS1正相關的基因與包括癌癥侵襲性增加、三苯氧胺耐藥性、臨床分級高、癌癥轉移等臨床特征顯著相關（圖3ab）。類似地，與DSCAM-AS1負相關的基因預示著更有利的臨床結果。對于大多數臨床特征，DSCAM-AS1正相關的基因表現出與那些與EZH2最相關的基因類似的臨床相關性，EZH2是一種已知的乳腺癌臨床侵襲性相關的基因標記（圖3b）。此外，對與DSCAM-AS1相關的所有基因進行基因集富集分析發現，這些基因與大量基因特征（例如乳腺癌發生、癌癥侵襲性、ER和三苯氧胺相關）顯著相關。雖然ER陽性乳腺癌通常導致更好的臨床結果，但在管腔型乳腺癌中，DSCAM-AS1在管腔B亞型中顯著高表達，而管腔B亞型乳腺癌是一種最具有臨床侵襲性的ER陽性乳腺癌臨床亞型（圖3c）。以上這些都說明了DSCAM-AS1與臨床侵襲性相關，但是在對來自TCGA的ER陽性乳腺樣本的生存分析中發現，DSCAM-AS1的表達并不是與臨床結果顯著相關。然而，對生存的明確評估可能需要對TCGA乳腺樣本進行更有力和更長期的臨床治療。
該課題組隨后研究了DSCAM-AS1在ER陽性乳腺癌細胞系中的致癌作用。在MCF7和T47D細胞系中，使用shRNA方法，DSCAM-AS1能夠被穩定敲除。DSCAM-AS1敲除后兩種細胞系的增殖能力都降低了（圖3d），侵襲能力也降低（圖3e），因此這些細胞也基本上無法在軟瓊脂中形成菌落（圖3f）。由于ER調節DSCAM-AS1的水平、ER的表達量和蛋白水平都不依賴于DSCAM-AS1的表達水平，因此排除了ER水平的改變而導致這種現象的可能性。此外，敲除DSCAM-AS1并沒有影響DSCAM基因的轉錄和翻譯水平，因為DSCAM-AS1在反義鏈和內含子區域。為了進一步證明DSCAM-AS1對侵襲性癌癥表型的影響，該課題組在T47D和ZR75-1細胞系中過表達DSCAM-AS1，這兩個細胞系是ER陽性乳腺癌細胞系，并且中度表達DSCAM-AS1（圖2c）。過表達實驗發現侵襲表型的增加（圖3g）。沒有選用MCF7細胞系來做過表達研究是因為DSCAM-AS1在該細胞系中已經有很高水平的表達量（圖2c）。過表達實驗也在MDA-MB-231細胞系中進行，這是一種常見的ER陰性細胞系。然而，外源DSCAM-AS1無法通過擴散和入侵致癌。這個現象可能是因為ER陽性細胞提供的必需的遺傳和表觀遺傳環境才可以使DSCAM-AS1具有侵襲性，該作用機制的闡明需要更多研究。此外，僅僅DSCAM-AS1并不能使細胞具有高度侵襲性。為了進一步調查DSCAM-AS1對癌癥表型的影響，該課題組進行了一次小鼠異種移植腫瘤生長測定，結果表明DSCAM-AS1的缺失能夠減少體內植入的T47D細胞的生長（圖3h）。敲除DSCAM-AS1后，植入細胞的轉移潛能也降低了（圖3i）。
圖3 DSCAM-AS1與癌癥侵襲相關。
4、hnRNPL在DSCAM-AS1機制中的作用
已有報道稱lncRNA通過與RNA、DNA或者蛋白綁定而行駛功能。因此，通過鑒定DSCAM-AS1的互作蛋白可以研究該lncRNA的致癌機制。為了鑒定DSCAM-AS1的互作蛋白，該課題組進行了pull-down實驗，并且對pull-down下來的產物進行質譜以確定與DSCAM-AS1綁定的蛋白（圖4a）。結果顯示，hnRNPL具有最高的光譜計數（圖4b），并且與hnRNPL形成復合體的蛋白PCBP2也具有相當高的光譜計數。因此接下來該課題組進一步探究DSCAM-AS1與hnRNPL的互作關系。hnRNPL是一種在多個組織中表達的蛋白，并且與調節RNA穩定性和影響基因表達相關。DSCAM-AS1與hnRNPL的綁定關系不僅僅在pull-down實驗中驗證，也在western-blot實驗中得到驗證（圖4c）。然而其他RNA結合蛋白并沒有綁定到DSCAM-AS1上，這說明DSCAM-AS1通常不會與RNA結合蛋白混雜結合（圖4c）。為了進一步證實這種綁定關系和特異性，該課題組使用針對hnRNPL的抗體進行了RNA免疫沉淀反應（RIP）。結果顯示，在MCF7和T47D細胞系中抗hnRNPL免疫共沉淀反應都大量富集了DSCAM-AS1，而對照組中幾乎無富集（圖4d）。此外，抗snRNP70和抗HuR免疫共沉淀反應都沒有pull-down下來DSCAM-AS1，這些結果說明了DSCAM-AS1與hnRNPL的綁定的特異性。
為了更具體地研究DSCAM-AS1和hnRNPL的功能，該課題組評估了敲除hnRNPL對過表達DSCAM-AS1產生的侵襲性的影響。結果顯示，降低hnRNPL的水平完全逆轉了過表達DSCAM-AS1產生的侵襲性（圖4e）。因為在對照細胞系中敲除hnRNPL只輕微地降低了侵襲性，而在過表達DSCAM-AS1細胞系中觀察到的侵襲明顯減少，這可能是由于hnRNPL影響了DSCAM-AS1獨有的侵襲機制。因此，為了進一步探究DSCAM-AS1和hnRNPL之間的功能關系，該課題組著手研究兩者之間的綁定位點。根據之前hnRNPL交聯-免疫沉淀測序（CLIP-seq）的研究，計算機預測DSCAM-AS1的綁定位點在3’端附近（圖4f）。研究報道hnRNPL綁定在富含CACA堿基的RNA位點，而預測的綁定區域有10個堿基對的CACA伸展。為了證明這個預測的區域是否真的綁定hnRNPL，該課題組構建了多個包含或者不包含綁定位點的突變體。DSCAM-AS1-5和DSCAM-AS1-3是大型缺失突變體，僅含有5’端和3’端，只有DSCAM-AS1-3突變體含有預測的綁定位點，DSCAM-AS1-D突變體在預測的綁定位點有27個核苷酸的刪除（圖4f,g）。這些突變體在HEK293細胞系中表達，因為該細胞系缺少內源性DSCAM-AS1的表達，但是仍然表達hnRNPL。結果顯示，通過pull-down實驗和western-blot實驗，預測的綁定位點的缺失能夠有效地消除hnRNPL蛋白的綁定（圖4g）。RNA二級結構是RNA功能性的重要組成部分，是RNA-蛋白質相互作用的關鍵因素。由于DSCAM-AS1-D突變體在預測的綁定位點的27個核苷酸的刪除是轉錄本的很小一部分，為了證明這個小片段刪除不會引起RNA二級結構的顯著變化，該課題組利用RNAfold結構預測軟件調查了該片段的刪除對RNA二級結構的影響。根據最小自由能預測，DSCAM-AS1和DSCAM-AS1-D的假定二級結構大體相似，說明hnRNPL未能綁定到DSCAM-AS1-D突變體并不是由于二級結構的變化。有趣的是，在T47D細胞系中過表達DSCAM-AS1-D突變體未能重演過表達DSCAM-AS1時觀察到的侵襲性增加（圖4h）。以上這些結果都證實在這些ER陽性乳腺癌細胞中，DSCAM-AS1通過與hnRNPL的相互作用來促進致癌性。
圖4 DSCAM-AS1和hnRNPL的功能關系。
5、DSCAM-AS1在三苯氧胺耐藥中的作用
存在一定數量的ER陽性乳腺癌患者對內分泌治療產生耐藥性，并且在臨床上表現出癌癥復發和轉移。因此，由于DSCAM-AS1與預后不良的ER陽性乳腺癌相關，該課題組著手研究DSCAM-AS1在推翻雌激素療法依賴性和促進抗雌激素療法方面的潛在功能。該課題組在1uM三苯氧胺中傳代MCF7細胞6個月，直到獲得能夠在三苯氧胺中生長的MCF7細胞的亞群，這些細胞被稱為三苯氧胺抗性MCF7細胞（TamR-MCF7）。有趣的是，雖然ER的靶標基因（GREB1和PGR）的表達量相對于親本MCF7細胞降低，但是盡管DSCAM-AS1已經在MCF7細胞中表達水平很高，其表達量仍顯著上升（圖5a）。ER水平也上升，這可能更像是作為對三苯氧胺的抗雌激素作用的持續反應的一種補償性上調。此外，三苯氧胺對親代MCF7細胞的短時間處理，8小時后使DSCAM-AS1水平降低，24小時后恢復到處理前的水平。相比之下，ER的靶標基因GREB1在短時間和長時間處理下都表現出明顯的表達減少。為了研究DSCAM-AS1在TamR-MCF7細胞中表達上調是否與其功能相關，該課題組評估了敲除DSCAM-AS1后的細胞增殖能力。在TamR-MCF7細胞中敲除DSCAM-AS1，將這些細胞在1uM三苯氧胺中培養，發現其增殖能力降低，與親代MCF7細胞在1uM三苯氧胺中培養的增殖能力水平差不多（圖5b）。此外，在這些細胞中敲除hnRNPL，與在TamR-MCF7細胞中增殖能力的缺失水平差不多，這表明DSCAM-AS1和hnRNPL可能都在促進三苯氧胺抗藥性的發展方面起到作用。
該課題組還調查了在T47D細胞系中過表達DSCAM-AS1后DSCAM-AS1傳遞三苯氧胺抗藥性的能力。過表達DSCAM-AS1 與三苯氧胺抗藥性的增長呈現劑量依賴性相關，在三苯氧胺含量低至100nM時，細胞活力顯著增加（圖5c）。此外，過表達DSCAM-AS1 的細胞在雌激素缺乏的培養基中表現出增殖優勢。這種增殖優勢在添加雌激素后消失，并且在添加三苯氧胺后又重新獲得。恰恰相反，該該課題組發現在T47D細胞中敲除DSCAM-AS1會導致雌激素依賴性增強。
為了證實這些體外實驗的發現，該課題組在原發和轉移的乳腺癌組織中產生了ER的ChIP-seq數據。這些腫瘤組織被分為以下幾組：ER陰性原發腫瘤、ER陽性原發并且三苯氧胺響應、ER陽性原發并且三苯氧胺不響應、ER陽性轉移腫瘤。引人注目的是，對DSCAM-AS1啟動子的研究表明，在具有臨床侵襲性的腫瘤中ER優先與DSCAM-AS1啟動子結合（圖5d），而ER的靶標基因GREB1幾乎在所有ER陽性腫瘤中都有ER在其啟動子區域綁定，并沒有在在具有臨床侵襲性的腫瘤中表現出傾向性?？傊?，這些數據表明了DSCAM-AS1的表達與具有臨床侵襲性ER陽性的乳腺癌樣本之間的聯系，這種聯系可以部分解釋為，DSCAM-AS1具有促進雌激素依賴性的致癌性，從而潛在地促進了使用三苯氧胺進行內分泌治療的耐藥性。
圖5 DSCAM-AS1與三苯氧胺耐藥性相關。
小結
本研究中，研究人員利用了58,648個注釋的長非編碼RNA（lncRNA）和947個乳腺癌亞型樣本，根據乳腺癌已知的分子亞型，基于lncRNA表達譜，對乳腺腫瘤進行了分類。研究人員還確定了一些乳腺癌和雌激素調節相關的lncRNA，并且具體研究了雌激素受體（ER）調節相關的lncRNA（DSCAM-AS1）的作用。他們證明了DSCAM-AS1介導的腫瘤發展和三苯氧胺（它莫西芬，一種抗雌激素）耐藥性，并且鑒定了一種參與DSCAM-AS1作用機制的蛋白hnRNPL。該研究通過強調DSCAM-AS1在乳腺癌生物學和治療耐藥中的作用，提供了對乳腺癌中lncRNA的潛在的臨床意義的見解。- 服務熱線
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