小RNA測序案例解讀
返回列表2019-01-21 15:09 編輯：admin
來自寄生植物菟絲子（Cuscuta campestris）的miRNA靶向宿主的mRNA
MicroRNAs from the parasitic plant Cuscuta campestris target host messenger RNAs
Nature (2018)553: 82–85
doi:10.1038/nature25027
菟絲子（Cuscuta campestris）的吸器能夠便于病毒、蛋白和mRNA的雙向移動，但是這些移動的具體功能還未知。菟絲子易受HIGS的影響，因此假設通過菟絲子的吸器小RNA可以與受體物種間進行交換，并且影響受體物種的基因表達。
利用寄生在擬南芥上的菟絲子進行小RNA高通量測序，共收集三種不同類型的組織，每種組織有兩個生物學重復。三種不同類型的組織分別如下：寄生莖，包括菟絲子吸器上不的莖；交界面，包括菟絲子的吸器和莖，以及擬南芥的莖；宿主莖，包括擬南芥在交界面上部的莖。
小RNA數據已上傳到NCBI GEO, 編號為GSE84955， 項目編號為PRJNA408115.
2. 主要分析流程
生物信息學分析：所有數據都在擬南芥和菟絲子中鑒定小RNA，并且進行差異表達分析, 鑒定和分析涉及的主要軟件有targetfinder.pl 和GSTAr.pl (小RNA靶向預測)、shortStack（小RNA測序分析）、strucVis（小RNA二級結構可視化）。
與寄生莖相比，交界處的寄生物的RNA與宿主的RNA相互稀釋，因此菟絲子小RNA位點的表達量在交界處都下調（圖1a）。然而，有76種菟絲子小RNA在交界處顯著上調（FDR≤0.05），其中43種（57％）miRNA在前體的發夾結構中具有離散的miRNA對中出現積累（圖1b）。同時來自RNA印跡的證據說明特定miRNA在交界面的特異性表達（圖1c）。 43種miRNA其中的一種是保守MIR164的一員， 其他42種上調的miRNA和已知miRNA序列相似性很低。在發芽四天并和寄主互作菟絲子材料中，通過PCR檢測到了了幾個miRNA。
圖1 菟絲子miRNA在吸器與擬南芥的交界面被誘導產生
2、菟絲子miRNA引起基因沉默和宿主mRNA產生siRNA
大多數菟絲子誘導的miRNA產生了22nt的成熟miRNA。這種22nt的miRNA在植物中發生頻率低于21個nt的miRNA，并且與次級siRNA密切相關,而次級siRNA被認為會擴大miRNA指向基因沉默。假設誘導產生的22nt的miRNA會導致形成次級siRNA。因此，在擬南芥miRNA測序數據中進行搜索包含miRNA互補位點并具有在界面處特異性積累siRNA的序列，共發現六個擬南芥mRNA符合：TIR1，AFB2和AFB3，編碼生長素受體，BIK1，編碼一種質膜定位所需的激酶， SEOR1，編碼韌皮部蛋白和HSFB4，它編碼預測的轉錄抑制因子。由這些mRNA產生的siRNA和其他實例的次級siRNA在大小分布，雙鏈積累和定相中的作用相似（圖2a，b）。 其中TIR1，AFB2和AFB3三個mRNA已知被22nt的miR393所靶向并在下游產生二級siRNA。而在寄生莖中，TIR1，AFB2和AFB3三個mRNA所產生的次級siRNA向上游移位，靠近和菟絲子miRNA互補的位點，暗示菟絲子產生的miRNA和miR393不相關，并觸發了和宿主交互界面的次級siRNA。對未加帽的mRNA片段的分析顯示在與菟絲子miRNA互補的所有位點均有定向切割的現象，特別是來自交互界面的樣品，同時在對照樣品中的miRNA沒有這個現象（圖2）。
圖2 菟絲子miRNA引起基因沉默和宿主mRNA產生siRNA。
3、菟絲子miRNA和它們的靶基因的效應
在擬南芥轉錄數據中，沒有找到任何靶向這六個擬南芥mRNA的擬南芥miRNA或siRNAs，也沒有發現任何內源性菟絲子次級siRNA對應于任何誘導產生的miRNA。這些觀察結果表明誘導產生的菟絲子miRNA避免靶向自身轉錄本，來自菟絲子的22nt的miRNA通過跨物種方式靶向擬南芥mRNA。這六個擬南芥mRNA中的五個相對于一般莖在寄生交界的莖中出現了顯著的表達降低（圖3a，藍色為對照樣本）。擬南芥中的次級siRNA的表達量積累部分依賴于內源基因DCL4同時完全依賴于RDR6(SGS2)。TIR1基因的次級siRNA表達量在sgs2-1突變體中表達量完全消失而在dcl4-2t中下降（圖3b），因此DCL4和RDR6對于次級siRNA十分作用,說明菟絲子誘導的miRNA在宿主細胞中活躍并激發了宿主中的沉默機制從而產生次級siRNA。在scz2, tir1-1/afb2-3等突變體作為宿主時，并未觀察到明顯菟絲子的生物量變化， 而在bik1突變體作為宿主時，菟絲子生物量發現顯著下調（P<0.5）(圖3c)。但是由于BIK1同時參與到植物發育和免疫中，其發育相關的功能可能會掩蓋其在和菟絲子相互作用中發揮的作用。而在seor1 或afb3-4突變體中觀察到菟絲子生物量顯著升高（P <0.05）（圖3c）。 因此，SEOR1和AFB3都有限制菟絲子在擬南芥上的生長。這種觀察與此前SEOR1和AFB3跨物種進行miRNA調控的假設一致。
圖3 菟絲子miRNA和它們靶基因之間的效應
4、菟絲子miRNA在宿主中的靶基因的保守性
菟絲子在雙子葉植物中有廣泛的宿主范圍。因此，在雙子葉植物中進行了同源基因與菟絲子 miRNA互補的mRNA。其中BIK1，SEOR1，TIR1和HSFB4的同源基因被作為候選目標，其中GAPDH僅能靶向一個物種（圖4a），所以得出結論BIK1，SEOR1，TIR1和HSFB4這四個基因能夠在多個雙子葉植物中靶向菟絲子miRNA。同時在本氏煙草中進行了和擬南芥相同的實驗和miRNA研究，和菟絲子接觸引發的miRNA位點在兩個物種間具有高度可重復性。幾種在本氏煙草中誘導產生餓菟絲子miRNA也通過RNA印跡實驗得到證實（圖4b）。通過對未加帽RNA末端的分析，說明了本氏煙草中miRNA對TIR1同源物的切割（圖4c，d）。這直接說明了相同的菟絲子 miRNA靶向不同物種中的同源宿主mRNA。同時在死竹子作為宿主進行菟絲子寄生的實驗說明活的宿主是菟絲子寄生產生的miRNA表達的必要條件（圖4b）。
圖4 菟絲子miRNA在宿主中的靶基因的保守性
MicroRNAs from the parasitic plant Cuscuta campestris target host messenger RNAs
Nature (2018)553: 82–85
doi:10.1038/nature25027
背景
在宿主引起的基因沉默（host-induced gene silencing，HIGS）機制中，siRNA產生的基因沉默靶向病原體和寄生物的mRNA。植物中的HIGS對于真菌、線蟲、昆蟲和寄生植物菟絲子十分有效。HIGS機制表明植物與寄生物之間存在自然的小RNA交換。與這個假設一致的是，來自植物病原菌灰霉菌（Botrytis cinerea）的小RNA在侵染的過程中靶向宿主mRNA，并且為了減少病原體的毒力HIGS靶向灰霉菌中的dicer-like的mRNA。相反地，棉花中的miRNA可以進入到真菌病原體（Verticillium dahliae）中。然而，植物與植物之間的miRNA的自然交流還沒有報導。菟絲子（Cuscuta campestris）的吸器能夠便于病毒、蛋白和mRNA的雙向移動，但是這些移動的具體功能還未知。菟絲子易受HIGS的影響，因此假設通過菟絲子的吸器小RNA可以與受體物種間進行交換，并且影響受體物種的基因表達。
主要材料方法
1. 材料與數據利用寄生在擬南芥上的菟絲子進行小RNA高通量測序，共收集三種不同類型的組織，每種組織有兩個生物學重復。三種不同類型的組織分別如下：寄生莖，包括菟絲子吸器上不的莖；交界面，包括菟絲子的吸器和莖，以及擬南芥的莖；宿主莖，包括擬南芥在交界面上部的莖。
小RNA數據已上傳到NCBI GEO, 編號為GSE84955， 項目編號為PRJNA408115.
2. 主要分析流程
生物信息學分析：所有數據都在擬南芥和菟絲子中鑒定小RNA，并且進行差異表達分析, 鑒定和分析涉及的主要軟件有targetfinder.pl 和GSTAr.pl (小RNA靶向預測)、shortStack（小RNA測序分析）、strucVis（小RNA二級結構可視化）。
主要結果
1、菟絲子miRNA在吸器與擬南芥的交界面被誘導產生與寄生莖相比，交界處的寄生物的RNA與宿主的RNA相互稀釋，因此菟絲子小RNA位點的表達量在交界處都下調（圖1a）。然而，有76種菟絲子小RNA在交界處顯著上調（FDR≤0.05），其中43種（57％）miRNA在前體的發夾結構中具有離散的miRNA對中出現積累（圖1b）。同時來自RNA印跡的證據說明特定miRNA在交界面的特異性表達（圖1c）。 43種miRNA其中的一種是保守MIR164的一員， 其他42種上調的miRNA和已知miRNA序列相似性很低。在發芽四天并和寄主互作菟絲子材料中，通過PCR檢測到了了幾個miRNA。
圖1 菟絲子miRNA在吸器與擬南芥的交界面被誘導產生
2、菟絲子miRNA引起基因沉默和宿主mRNA產生siRNA
大多數菟絲子誘導的miRNA產生了22nt的成熟miRNA。這種22nt的miRNA在植物中發生頻率低于21個nt的miRNA，并且與次級siRNA密切相關,而次級siRNA被認為會擴大miRNA指向基因沉默。假設誘導產生的22nt的miRNA會導致形成次級siRNA。因此，在擬南芥miRNA測序數據中進行搜索包含miRNA互補位點并具有在界面處特異性積累siRNA的序列，共發現六個擬南芥mRNA符合：TIR1，AFB2和AFB3，編碼生長素受體，BIK1，編碼一種質膜定位所需的激酶， SEOR1，編碼韌皮部蛋白和HSFB4，它編碼預測的轉錄抑制因子。由這些mRNA產生的siRNA和其他實例的次級siRNA在大小分布，雙鏈積累和定相中的作用相似（圖2a，b）。 其中TIR1，AFB2和AFB3三個mRNA已知被22nt的miR393所靶向并在下游產生二級siRNA。而在寄生莖中，TIR1，AFB2和AFB3三個mRNA所產生的次級siRNA向上游移位，靠近和菟絲子miRNA互補的位點，暗示菟絲子產生的miRNA和miR393不相關，并觸發了和宿主交互界面的次級siRNA。對未加帽的mRNA片段的分析顯示在與菟絲子miRNA互補的所有位點均有定向切割的現象，特別是來自交互界面的樣品，同時在對照樣品中的miRNA沒有這個現象（圖2）。
圖2 菟絲子miRNA引起基因沉默和宿主mRNA產生siRNA。
3、菟絲子miRNA和它們的靶基因的效應
在擬南芥轉錄數據中，沒有找到任何靶向這六個擬南芥mRNA的擬南芥miRNA或siRNAs，也沒有發現任何內源性菟絲子次級siRNA對應于任何誘導產生的miRNA。這些觀察結果表明誘導產生的菟絲子miRNA避免靶向自身轉錄本，來自菟絲子的22nt的miRNA通過跨物種方式靶向擬南芥mRNA。這六個擬南芥mRNA中的五個相對于一般莖在寄生交界的莖中出現了顯著的表達降低（圖3a，藍色為對照樣本）。擬南芥中的次級siRNA的表達量積累部分依賴于內源基因DCL4同時完全依賴于RDR6(SGS2)。TIR1基因的次級siRNA表達量在sgs2-1突變體中表達量完全消失而在dcl4-2t中下降（圖3b），因此DCL4和RDR6對于次級siRNA十分作用,說明菟絲子誘導的miRNA在宿主細胞中活躍并激發了宿主中的沉默機制從而產生次級siRNA。在scz2, tir1-1/afb2-3等突變體作為宿主時，并未觀察到明顯菟絲子的生物量變化， 而在bik1突變體作為宿主時，菟絲子生物量發現顯著下調（P<0.5）(圖3c)。但是由于BIK1同時參與到植物發育和免疫中，其發育相關的功能可能會掩蓋其在和菟絲子相互作用中發揮的作用。而在seor1 或afb3-4突變體中觀察到菟絲子生物量顯著升高（P <0.05）（圖3c）。 因此，SEOR1和AFB3都有限制菟絲子在擬南芥上的生長。這種觀察與此前SEOR1和AFB3跨物種進行miRNA調控的假設一致。
圖3 菟絲子miRNA和它們靶基因之間的效應
4、菟絲子miRNA在宿主中的靶基因的保守性
菟絲子在雙子葉植物中有廣泛的宿主范圍。因此，在雙子葉植物中進行了同源基因與菟絲子 miRNA互補的mRNA。其中BIK1，SEOR1，TIR1和HSFB4的同源基因被作為候選目標，其中GAPDH僅能靶向一個物種（圖4a），所以得出結論BIK1，SEOR1，TIR1和HSFB4這四個基因能夠在多個雙子葉植物中靶向菟絲子miRNA。同時在本氏煙草中進行了和擬南芥相同的實驗和miRNA研究，和菟絲子接觸引發的miRNA位點在兩個物種間具有高度可重復性。幾種在本氏煙草中誘導產生餓菟絲子miRNA也通過RNA印跡實驗得到證實（圖4b）。通過對未加帽RNA末端的分析，說明了本氏煙草中miRNA對TIR1同源物的切割（圖4c，d）。這直接說明了相同的菟絲子 miRNA靶向不同物種中的同源宿主mRNA。同時在死竹子作為宿主進行菟絲子寄生的實驗說明活的宿主是菟絲子寄生產生的miRNA表達的必要條件（圖4b）。
圖4 菟絲子miRNA在宿主中的靶基因的保守性
小結
菟絲子（Cuscuta spp.）是一種專門寄生的植物，它通過吸器從宿主植物的莖中吸收水分和養分。菟絲子的吸器促進了宿主和寄生物之間的病毒、蛋白、mRNA的雙向移動，但是這些雙向移動的功能效果目前還未知。本次研究揭示了菟絲子（Cuscuta campestris）在寄生到擬南芥上后，其吸器中積累了大量的新的miRNA，并且大多數這種miRNA是22nt。在植物中22nt長的miRNA并不常見，并且可能與次級siRNA（siRNA）產生與靶沉默的擴增相關。在寄生狀態，有些22nt的菟絲子miRNA靶向擬南芥的mRNA，從而導致mRNA分裂、二級siRNA產生和mRNA積累量的下降。宿主中編碼靶向mRNA的兩個位點的突變支持菟絲子顯著更高的生長。菟絲子寄生到擬南芥上時表達和活躍的miRNA，也在菟絲子寄生到本氏煙（Nicotiana benthamiana）時表達和活躍。多個其他植物物種中靶mRNA的同源基因也含有能夠誘導菟絲子miRNA的預測靶向位點。這些數據揭示菟絲子miRNA能夠調節宿主基因的表達，并且表明它們可能在寄生時作為毒力因素。- 服務熱線
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