甲基化測序案例解讀-醫學
返回列表2019-01-21 15:05 編輯：admin
甲基化組比較分析鑒定人類大腦進化中的表觀遺傳調節位點
Comparative Methylome Analyses Identify Epigenetic Regulatory Loci of Human Brain Evolution
Molecular Biology Evolution (2018) 33(11):2947–2959
doi:10.1093/molbev/msw176
人類大腦非常特別，與其他動物相比，人類大腦所占身體比例要高很多，而且這是在短暫的時間內變化而成。已有分析證明進化在多個層次改變了人類大腦，而有趣的是，目前人類大腦相關研究發現表觀遺傳機制在
大腦的調節功能，發育和神經反應等方法具有至關重要的作用。
目前研究開始闡明人類和非人類靈長類動物的大腦之間的表觀遺傳差異。已有研究通過對人類和黑猩猩大腦全基因組甲基化組圖譜進行比較，但關注點僅為基因啟動子區域，并未對可能的甲基化差異區域進行分析。同時也缺少外類群物種進行比較，限制了對人類甲基化特異性的推斷。重要的是，大量腦樣本的數據集對于確定高可信度的物種水平表觀遺傳分歧結果至關重要。
• 本文測序的大腦全基因組轉錄組測序數據數據編號為GSE77124以及全基因組甲基化測序數據和驗證數據編號GSE85868。文章中分析用到的人類和黑猩猩的前額皮質的WGBS數據的數據編號是GSE37202。
2. 主要分析流程：
（1）序列比對及差異甲基化區域（DMR）鑒定
原始序列通過FastQC和TrimGalore進行質量控制并去除接頭序列以及低質量序列。甲基化數據通過Bismark和BsMap比對到人類、黑猩猩和獼猴的參考基因組（版本分別是hg19、pantro4和rheMac3），并將有相同開頭結尾的序列當作冗余去除。比對后的結果通過BSmooth進行DMR的鑒定，初步鑒定出的候選DMR首先必須含有在至少兩個個體中有兩條讀序支持的CpG位點，同時每個候選DMR中必須包含超過10個CpG位點以及兩個物種間的最小部分甲基化差異水平在0.3。兩者比對工具鑒定出的DMR結合出最終結果。
（2）DMR 特異性鑒定 （人類或黑猩猩）
獼猴的甲基化數據被用于DMR的特異性鑒定。當人和獼猴之間的甲基化差異大于黑猩猩和獼猴之間的甲基化差異時，這類DMR被認定為人類特異的DMR。其中的具體鑒定標準為：人和獼猴的差異應大于0.15。
（3）DMR 功能注釋
本文通過ChiPSeeker軟件根據UCSC數據庫中的KnowGene對DMR進行功能注釋。GO注釋通過GoStat R包和13455人類黑猩猩同源基因集進行注釋。GWAS富集分析通過traseR 軟件包完成，并結合dbGaP、NHGRI GWAS Catalog以及HapMap CEU population等數據集對GWAS位點綜合進行注釋。
（4）DMR 表觀遺傳學特性鑒定
本文通過對人類特有的H3K4me3標記位點、4D基因組數據庫的染色質互作、ENCODE的ChiP-Seq實驗數據以及Roadmap表觀組學等數據集進行分析來獲得DMR相關的表觀遺傳學特性。著重對ENCODE項目中的來自91個不同組織的人類細胞系的ChiP-Seq實驗數據結合轉錄因子進行分析來觀測。
（5）基因表達量分析
對人類特有DMR（包括人類和黑猩猩以及獼猴的分別比較）進行觀測是否會有顯著的表達量變化。為了檢測基因組水平上的顯著性，在觀測DMR基因表達量的同時，從所有基因中挑選相同數量的基因進行觀測表達量的增長或減少，這樣的分析共進行1000次并挑選出其中P<0.0.5的結果。
通過對三個人，三只黑猩猩以及兩只恒河猴的相同腦區進行全基因組亞硫酸氫鹽測序（WGBS），對人類和黑猩猩大腦大腦進行了DMR的首次鑒定，共鑒定出278個初步鑒定的DMR。同時利用兩只恒河猴的WGBS數據來估計人類和黑猩猩的DMR物種特異性，共確定其中85個人類特異和102個黑猩猩特異的DMR。有趣的是，人類中去甲基化差異區域（hypo-DMR）明顯更多。
為了進一步確定初步鑒定的DMR的可靠性，即是否會由于不同個體的DNA差異而造成影響，因此進行了全基因組深度測序以及增加了一些額外的樣本對278個DMR中的38個進行了目標區域的甲基化水平測定。如圖 1所示，所有驗證的DMR都顯示出在人類與黑猩猩之間的差異，同時在加入更多的人類樣本以及其他靈長類樣本的情況下，人類特異性的DMR鑒定結果也和之前保持一致，說明一些物種特異DMR和物種差異相關聯。同時通過深度測序也排除了核酸多態性會對DMR甲基化模式的影響。
靈長類動物的前額皮質由不同的細胞組成類型，最顯著的是神經膠質和神經元細胞，它們可能表現出某些位點的不同表觀遺傳模式。通過對神經元細胞和非神經元細胞在人類和黑猩猩中進行甲基化數據比較，發現并沒有顯著的差異變化。
圖1 DMR鑒定結果。
2. DMR的基因組注釋
在人類和黑猩猩大腦之間鑒定出的DMR平均長度為584 bp（67~2,015 bp）， 并且存在顯著的CpG位點的富集現象。在對這些DMR在基因組的位置進行觀察時發現大約一半的DMR（46％）位于啟動子區域（圖2）。
為了進一步深入了解DMR的功能，對DMR以及附近區域進行GO富集分析和進行GWAS分析。發現DMR以及鄰近區域內的基因顯著富集在幾種GO發育過程中，包括神經系統發育，前腦發育和胚胎形態發生。在GWAS結果中，146個DMR區域與GWAS信號重疊，其中，24個DMR與大腦相關性狀相關的變異相關，包括神經系統疾病相關，如阿斯伯格和阿斯伯格帕金森病。而人類特有的DMR在免疫翻譯，骨骼和牙齒發育，這些和人類近期進化十分關聯的性狀上顯著富集。這說明這些和大腦發育以及相關性狀的DMR和人類近期進行十分關聯。
圖2 DMR基因組注釋。
3. DMR和表觀遺傳學證據的一致性
研究將一組前額皮質神經元數據的染色質標記H3K4me3修飾數據進行比較，發現DMR（去甲基化或過甲基化）在人類特異的H3K4me3富集或消減區域對應顯著富集（圖 3），這些結果說明人類大腦表觀遺傳學的協同變化，包括H3K4me3和DNA甲基化。
圖3 DMR與表觀遺傳變化之間的協同性。
在三維基因組中，尤其是在亞TAD水平上，遠端序列之間的相互作用（例如增強子和啟動子之間）通常是由染色質環完成。而染色質環通過增強啟動子相互作用來促進轉錄調控。結合4D 基因組數據庫，在32個特異DMR中發現了19個顯著的互作，并且這些互作的主要都發生在同一DMR或者鄰近的兩個DMR中。在對所有DMR的互作分析中，發現了近一半的DMR（132）和DMR區域有相互作用，247個DMR和非DMR區域有互作。說明DMR優先在會發生染色質環的區域并且有可能參與轉錄調控。
通過六種染色質標記對98種不同組織的DMR的染色質狀態進行了調查，發現人類特異的去甲基化DMR的染色質狀態是顯著活性調節的，主要是啟動子和增強子（圖4），而大部分過甲基化DMR的染色質狀態通常卻被歸為沉默一類。有趣的是，低甲基化DMR的啟動子和增強子的染色質狀態在人腦等組織中活性是最高的。
圖4 人類不同組織的去甲基化DMR的染色質狀態。
4. DMR和轉錄因子（TF）綁定信號以及綁定位點（TFBS）和基因表達相關聯
通過對ENCODE項目中來自不同組織的91種人類細胞系進行了161個TF（轉錄因子）的結合位點研究，發現DMR高度富集在經實驗驗證的功能性轉錄因子結合位點（TFBS）上，其中大多數DMR（84.5％）與TFBS重疊，并且人類特異性的去甲基化DMR比過甲基化在TFBS富集更加明顯。而且，我們發現四個TF和DMR的結合超過預期，其中我們發現了轉錄因子NRF1 和BRF1，分別和神經退行性疾病以及神經發育通路相關。實驗結果支持了TF和DMR結合并調節啟動子以及增強表觀遺傳特征，說明DMR在人腦中是具有調節作用的熱點區域。相對應，文章通過檢測DMR和基因表達的關系，發現人類特有DMR和人類特異表達模式相關聯，說明人類特有DMR和鄰近的基因表達相關聯。
圖5 DMR中的TFBS位點分析。
通過對去甲基化DMR內部或者周圍（± 3kb）的新近產生的TFBS的單核苷酸替換進行檢測，共鑒定出了51個TFBS中的41個人類特有單核苷酸替換。其中一個轉錄因子綁定位點PSMB2基因中存在的人類特有單核苷酸替換影響了它的啟動子（圖5B），而這個TFBS所對應的轉錄因子為BHLHE4基因。而轉錄因子BHLHE4基因是一個著名的生物鐘基因，它的表達和重度抑郁癥失調相關聯。對應的轉錄因子綁定位點PSMB2基因的表達水平相對于黑猩猩和獼猴在人腦中顯著增加（圖5C）。除此以外，仍有許多轉錄因子和低甲基化DMR區域表現出綁定的可能，例如語言相關基因組FOXP2基因等。有趣的是，在DMR中觀察的產生TFBS的突變速率要遠比DMR之外低得多，表明這種突變在功能受限，在調控較強的區域不常發生。
2． 人類和黑猩猩之間鑒定出的DMR大約一半落在啟動子區域，而人類特有的DMR在免疫翻譯，骨骼和牙齒發育等和人類近期進化相關功能顯著富集，說明人類大腦特有DMR和人類近期進化十分相關。
3． DMR和表觀遺傳學數據，包括染色質標記、三維基因中互作等，存在相當的關聯，比如DMR優先在會發生染色質環的區域，說明DMR有可能參與到轉錄調控。
4． DMR尤其是人類特有DMR和鄰近基因表達相關聯，DMR通過轉錄因子綁定位點來調節啟動子以增強表觀特征，說明DMR在人腦中是具有調節作用的熱點區域。
Comparative Methylome Analyses Identify Epigenetic Regulatory Loci of Human Brain Evolution
Molecular Biology Evolution (2018) 33(11):2947–2959
doi:10.1093/molbev/msw176
背景
表觀遺傳學在發育、基因印記和疾病研究中有著重要作用，但是表觀遺傳在世代更替中遺傳以及所帶來的遺傳結果仍然懸而未決。更不確定的是表觀遺傳信號在進化中是如何分化及其具體功能變化。人類大腦非常特別，與其他動物相比，人類大腦所占身體比例要高很多，而且這是在短暫的時間內變化而成。已有分析證明進化在多個層次改變了人類大腦，而有趣的是，目前人類大腦相關研究發現表觀遺傳機制在
大腦的調節功能，發育和神經反應等方法具有至關重要的作用。
目前研究開始闡明人類和非人類靈長類動物的大腦之間的表觀遺傳差異。已有研究通過對人類和黑猩猩大腦全基因組甲基化組圖譜進行比較，但關注點僅為基因啟動子區域，并未對可能的甲基化差異區域進行分析。同時也缺少外類群物種進行比較，限制了對人類甲基化特異性的推斷。重要的是，大量腦樣本的數據集對于確定高可信度的物種水平表觀遺傳分歧結果至關重要。
主要材料方法
1. 數據：• 本文測序的大腦全基因組轉錄組測序數據數據編號為GSE77124以及全基因組甲基化測序數據和驗證數據編號GSE85868。文章中分析用到的人類和黑猩猩的前額皮質的WGBS數據的數據編號是GSE37202。
2. 主要分析流程：
（1）序列比對及差異甲基化區域（DMR）鑒定
原始序列通過FastQC和TrimGalore進行質量控制并去除接頭序列以及低質量序列。甲基化數據通過Bismark和BsMap比對到人類、黑猩猩和獼猴的參考基因組（版本分別是hg19、pantro4和rheMac3），并將有相同開頭結尾的序列當作冗余去除。比對后的結果通過BSmooth進行DMR的鑒定，初步鑒定出的候選DMR首先必須含有在至少兩個個體中有兩條讀序支持的CpG位點，同時每個候選DMR中必須包含超過10個CpG位點以及兩個物種間的最小部分甲基化差異水平在0.3。兩者比對工具鑒定出的DMR結合出最終結果。
（2）DMR 特異性鑒定 （人類或黑猩猩）
獼猴的甲基化數據被用于DMR的特異性鑒定。當人和獼猴之間的甲基化差異大于黑猩猩和獼猴之間的甲基化差異時，這類DMR被認定為人類特異的DMR。其中的具體鑒定標準為：人和獼猴的差異應大于0.15。
（3）DMR 功能注釋
本文通過ChiPSeeker軟件根據UCSC數據庫中的KnowGene對DMR進行功能注釋。GO注釋通過GoStat R包和13455人類黑猩猩同源基因集進行注釋。GWAS富集分析通過traseR 軟件包完成，并結合dbGaP、NHGRI GWAS Catalog以及HapMap CEU population等數據集對GWAS位點綜合進行注釋。
（4）DMR 表觀遺傳學特性鑒定
本文通過對人類特有的H3K4me3標記位點、4D基因組數據庫的染色質互作、ENCODE的ChiP-Seq實驗數據以及Roadmap表觀組學等數據集進行分析來獲得DMR相關的表觀遺傳學特性。著重對ENCODE項目中的來自91個不同組織的人類細胞系的ChiP-Seq實驗數據結合轉錄因子進行分析來觀測。
（5）基因表達量分析
對人類特有DMR（包括人類和黑猩猩以及獼猴的分別比較）進行觀測是否會有顯著的表達量變化。為了檢測基因組水平上的顯著性，在觀測DMR基因表達量的同時，從所有基因中挑選相同數量的基因進行觀測表達量的增長或減少，這樣的分析共進行1000次并挑選出其中P<0.0.5的結果。
主要結果
1. 人類大腦中全基因組DMR的鑒定通過對三個人，三只黑猩猩以及兩只恒河猴的相同腦區進行全基因組亞硫酸氫鹽測序（WGBS），對人類和黑猩猩大腦大腦進行了DMR的首次鑒定，共鑒定出278個初步鑒定的DMR。同時利用兩只恒河猴的WGBS數據來估計人類和黑猩猩的DMR物種特異性，共確定其中85個人類特異和102個黑猩猩特異的DMR。有趣的是，人類中去甲基化差異區域（hypo-DMR）明顯更多。
為了進一步確定初步鑒定的DMR的可靠性，即是否會由于不同個體的DNA差異而造成影響，因此進行了全基因組深度測序以及增加了一些額外的樣本對278個DMR中的38個進行了目標區域的甲基化水平測定。如圖 1所示，所有驗證的DMR都顯示出在人類與黑猩猩之間的差異，同時在加入更多的人類樣本以及其他靈長類樣本的情況下，人類特異性的DMR鑒定結果也和之前保持一致，說明一些物種特異DMR和物種差異相關聯。同時通過深度測序也排除了核酸多態性會對DMR甲基化模式的影響。
靈長類動物的前額皮質由不同的細胞組成類型，最顯著的是神經膠質和神經元細胞，它們可能表現出某些位點的不同表觀遺傳模式。通過對神經元細胞和非神經元細胞在人類和黑猩猩中進行甲基化數據比較，發現并沒有顯著的差異變化。
圖1 DMR鑒定結果。
2. DMR的基因組注釋
在人類和黑猩猩大腦之間鑒定出的DMR平均長度為584 bp（67~2,015 bp）， 并且存在顯著的CpG位點的富集現象。在對這些DMR在基因組的位置進行觀察時發現大約一半的DMR（46％）位于啟動子區域（圖2）。
為了進一步深入了解DMR的功能，對DMR以及附近區域進行GO富集分析和進行GWAS分析。發現DMR以及鄰近區域內的基因顯著富集在幾種GO發育過程中，包括神經系統發育，前腦發育和胚胎形態發生。在GWAS結果中，146個DMR區域與GWAS信號重疊，其中，24個DMR與大腦相關性狀相關的變異相關，包括神經系統疾病相關，如阿斯伯格和阿斯伯格帕金森病。而人類特有的DMR在免疫翻譯，骨骼和牙齒發育，這些和人類近期進化十分關聯的性狀上顯著富集。這說明這些和大腦發育以及相關性狀的DMR和人類近期進行十分關聯。
圖2 DMR基因組注釋。
3. DMR和表觀遺傳學證據的一致性
研究將一組前額皮質神經元數據的染色質標記H3K4me3修飾數據進行比較，發現DMR（去甲基化或過甲基化）在人類特異的H3K4me3富集或消減區域對應顯著富集（圖 3），這些結果說明人類大腦表觀遺傳學的協同變化，包括H3K4me3和DNA甲基化。
圖3 DMR與表觀遺傳變化之間的協同性。
在三維基因組中，尤其是在亞TAD水平上，遠端序列之間的相互作用（例如增強子和啟動子之間）通常是由染色質環完成。而染色質環通過增強啟動子相互作用來促進轉錄調控。結合4D 基因組數據庫，在32個特異DMR中發現了19個顯著的互作，并且這些互作的主要都發生在同一DMR或者鄰近的兩個DMR中。在對所有DMR的互作分析中，發現了近一半的DMR（132）和DMR區域有相互作用，247個DMR和非DMR區域有互作。說明DMR優先在會發生染色質環的區域并且有可能參與轉錄調控。
通過六種染色質標記對98種不同組織的DMR的染色質狀態進行了調查，發現人類特異的去甲基化DMR的染色質狀態是顯著活性調節的，主要是啟動子和增強子（圖4），而大部分過甲基化DMR的染色質狀態通常卻被歸為沉默一類。有趣的是，低甲基化DMR的啟動子和增強子的染色質狀態在人腦等組織中活性是最高的。
圖4 人類不同組織的去甲基化DMR的染色質狀態。
4. DMR和轉錄因子（TF）綁定信號以及綁定位點（TFBS）和基因表達相關聯
通過對ENCODE項目中來自不同組織的91種人類細胞系進行了161個TF（轉錄因子）的結合位點研究，發現DMR高度富集在經實驗驗證的功能性轉錄因子結合位點（TFBS）上，其中大多數DMR（84.5％）與TFBS重疊，并且人類特異性的去甲基化DMR比過甲基化在TFBS富集更加明顯。而且，我們發現四個TF和DMR的結合超過預期，其中我們發現了轉錄因子NRF1 和BRF1，分別和神經退行性疾病以及神經發育通路相關。實驗結果支持了TF和DMR結合并調節啟動子以及增強表觀遺傳特征，說明DMR在人腦中是具有調節作用的熱點區域。相對應，文章通過檢測DMR和基因表達的關系，發現人類特有DMR和人類特異表達模式相關聯，說明人類特有DMR和鄰近的基因表達相關聯。
圖5 DMR中的TFBS位點分析。
通過對去甲基化DMR內部或者周圍（± 3kb）的新近產生的TFBS的單核苷酸替換進行檢測，共鑒定出了51個TFBS中的41個人類特有單核苷酸替換。其中一個轉錄因子綁定位點PSMB2基因中存在的人類特有單核苷酸替換影響了它的啟動子（圖5B），而這個TFBS所對應的轉錄因子為BHLHE4基因。而轉錄因子BHLHE4基因是一個著名的生物鐘基因，它的表達和重度抑郁癥失調相關聯。對應的轉錄因子綁定位點PSMB2基因的表達水平相對于黑猩猩和獼猴在人腦中顯著增加（圖5C）。除此以外，仍有許多轉錄因子和低甲基化DMR區域表現出綁定的可能，例如語言相關基因組FOXP2基因等。有趣的是，在DMR中觀察的產生TFBS的突變速率要遠比DMR之外低得多，表明這種突變在功能受限，在調控較強的區域不常發生。
小結
1． 通過比較人類和黑猩猩大腦全基因組甲基化數據并加入獼猴數據作為外類群，鑒定出了278個人類特有DMR，并對其中38個進行獨立的區域深度測序和重亞硫酸鹽測序，證明了結果的可靠性。2． 人類和黑猩猩之間鑒定出的DMR大約一半落在啟動子區域，而人類特有的DMR在免疫翻譯，骨骼和牙齒發育等和人類近期進化相關功能顯著富集，說明人類大腦特有DMR和人類近期進化十分相關。
3． DMR和表觀遺傳學數據，包括染色質標記、三維基因中互作等，存在相當的關聯，比如DMR優先在會發生染色質環的區域，說明DMR有可能參與到轉錄調控。
4． DMR尤其是人類特有DMR和鄰近基因表達相關聯，DMR通過轉錄因子綁定位點來調節啟動子以增強表觀特征，說明DMR在人腦中是具有調節作用的熱點區域。
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