全外顯子測序案例解讀
返回列表2019-01-21 15:03 編輯：admin
全外顯子組測序顯示HSPA1L是自發性早產的遺傳風險因子
Whole exome sequencing reveals HSPA1L as a genetic risk factor for spontaneous preterm birth
PLoS Genetics (2018) 14(7): e1007394
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1007394
絕大多數（約70％）早產是在自發性分娩后發生的。大部分自發的早產兒
分娩是自發性的;然而，家族內部的早產復發情況表明遺傳因素可能很重要。遺傳因素估計占出生時間變異的25-40％，母體基因組在早產中起主要作用，但不僅僅是。盡管自發性早產已經有很多遺傳研究在進行，只發現少數變異與此有關
同時其功能含義尚不清楚。
先前自發性早產全基因組關聯分析（GWAS）發現了涉及其中的一些常見變異，但也只解釋了遺傳風險中的一小部分。而稀有變異在自發性早產中的作用基本上是未開發的。全外顯子組測序（WES）識別罕見變異與疾病相關變異為提供了全面的的基礎。以前的早產測序研究或早產分娩前胎膜破裂（PPROM） 只少數候選基因區域，因此錯過了基因組的大部分編碼區。與全基因組測序不同，WES更便宜，也同樣可以解釋結果。
另外四個為有早產歷史的祖母，早產雙胎妊娠或晚期早產；二是驗證重復群體（Replication population），共有來自丹麥95個家庭的192個女性，這其中包括93對姐妹（姐妹均早產）和兩組三個姐妹均是早產，其中這里早產的定義為37個完整的妊娠周之前完成早產，其中83%的姐妹都有個一次自發性早產，這里所有的女性均是歐洲血統。研發群體的17個個體均進行全血和唾液樣本的DNA采集并通過Illumina HiSeq 2500 進行PE125的全外顯子測序。驗證重復群體的192個個體通過BGI的Exon Kit進行外顯子捕獲并進行PE35的全外顯子測序。
2. 主要分析流程：
圖1 外顯子測序分析流程
a. 變異尋找，利用bwa-mem和GATK進行
b. 變異注釋、過濾和篩選，其中序列覆蓋度<15，變異質量<20被過濾，進一步稀有變異和可能具有功能或造成功能變化的基因被保留。
c. 顯性遺傳基因過濾，群體中所有個體都有的基因中的稀有變異會被考慮調查，當具體某個家庭特殊的分析中，只有家庭內的所有個體均包含的變異會被考慮。
d. 通路分析，Ingenuity Variant Analysis為之前過濾的結果提供了顯著通路注釋，其中P-value通過和已有表型涉及基因進行重跌的Fisher檢測，只有P<0.01的通路用于進一步分析。
e. GWAS分析，結合已有早產相關GWAS數據，包括來自23andMe的43，568個歐洲血統的母親數據，來自Nordic的4，632個歐洲血統的母親數據以及來自芬蘭北部的608個經過質量控制的母親數據。利用Illumina 人類CoreExome芯片進行基因分型，并利用ShapeIT2和IMPUTE2進行prephasing和imputation，關聯分析通過SNPTEST v2.5.2完成。
f. 實驗驗證，通過桑格測序、體外實驗功能驗證、蛋白質模型預測、Western blotting以及qPCR進行等進行驗證。
研發群體（Discovery population）。選取了17個個體中情況最嚴重的10個個體進行分析，共在406個基因中鑒定出1，510個符合標準的稀有變異，在這其中鑒定出64個通路，其中三個最顯著的通路（p<=9.80e-7）在所有10個個體均有，為糖皮質激素受體信號、雌激素受體信號傳導和AMPK信號通路?；趩蝹€家庭最少有兩個個體的顯性遺傳模型分析，平均鑒定出在243個基因（173~381）共有444個變異（278~691）通路分析發現糖皮質激素受體信號通路為所有家庭所共有，而雌激素受體信號傳導同為三個家庭所有共有（p<0.01）,其中糖皮質激素受體信號通路和雌激素受體信號通路的一些基因在超過一個家庭中基因型相同，有可能是疾病病因。
驗證重復群體（Replication population）。在以家庭為單位（每個家庭的個體均共享的變異），所有93對姐妹中平均在593個基因（357~1112）中鑒定出807個變異（504~1553），糖皮質激素受體信號通路和雌激素受體信號通路分別在75個和79個家庭中發現。
2. 不同全外顯子分析軟件分析結果比較及兩個群體的稀有變異比較
Ingenuity Variant Analysis, Varseq 和 CMH Variant Warehouse三個外顯子分析軟件被用于分析。只有通過之前優化步驟并且三個軟件中至少兩個軟件的稀有變異被認為是有效的。這樣的好處是極大的降低了分析的假陽性錯誤率，這樣共在研發群體中鑒定出844個變異。而對于驗證重復群體，共鑒定出8，431個變異通過兩個軟件的檢測，其中CMH Variant Warehouse對于該群體不可行。對于兩個群體，變異的效應被分為功能丟失、中等或者其他幾大類。
3. HSPA1L變異與GWAS數據集（40，000母親）的早產相關
稀有變異分析結果和23andMe、北部歐洲的大量母親數據進行GWAS分析發現，在23andMe中的早產數據集中，在糖皮質激素受體信號通路的HSPA1L中的rs34620296的次要等位基因要比對照中基因頻率更高（0.0025而對照僅有0.0010，p=0.002）。同時這樣的關聯和早產時間也是顯著關聯的（p=0.0016，效應值-0.8238，標準誤0.2608）。
表3 HSPA1L變異的GWAS分析結果和自發性早產的關聯
4. 通過Sanger 測序驗證HSPA1L中的變異以及家庭成員的表型
在研究群體中通過Sanger測序驗證了HSPA1L中的兩個造成錯義的稀有變異，rs34620296 和rs150472288。同時這兩個變異在六個來自四個不相干家庭的母親中發現。在驗證群體中的兩個家庭中發現帶有母系遺傳的rs150472288 T等位基因的女性是早產兒，同時，兩個帶有母系遺傳的rs150472288 T等位基因的男性也是早產兒，但是這些攜帶者由于數量過少而難以之間下結論。
5. HSPA1L變異的潛在功能影響評估
對來自研究群體的rs34620296 和rs150472288以及來自驗證重復群體的rs482145 和 rs139193421利用SIFT和PolyPhen-2進行計算機模擬致病性預測。同時，MutationTaster和MutationAssessor將所有四種變異分別預測為致病和預測功能性。根據CADD（Combined Annotation Dependent Depletion）評分（>20），除了rs139193421之外的變異，均為人類基因組中前1%的致死性變異。
表4 HSPA1L錯義變異的功能預測
為了評估這些變異對轉錄活性的潛在影響，利用組蛋白修飾或DNase I超敏反應的證據進行評估。其中HaploReg4.1和RegulomeDB評價的結果顯示所有四種變體都具有組蛋白標記的區域，以及免疫系統各種細胞中強大的轉錄調控特征，尤其是來自外周血的T淋巴細胞（表4）。同時在HeLa-S3宮頸癌細胞系中和包皮成纖維細胞原代細胞分別發現rs34620296和rs482145的積極轉錄證據（表4）。同時在在卵巢組織中和腰肌組織中分別發現rs150472288和rs13919342的1DNA活性的進一步證據（表4）。還有證據表明在卵巢和胎兒腎上腺中rs34620296和rs150472288具有轉錄作用。將來自HaploReg 4.1和RegulomeDB的結果匯集在一起發現，HSPA1L變異參與到內分泌系統以及適應性免疫細胞中。這些變異因此可以在SPTB的病因學中發揮作用。
圖2 HSPA1L變異在蛋白質序列和結構上的效應
通過對HSPA1L變異rs34620296在蛋白質結構的可能效應進行調查，發現這個變異造成了氨基酸變化Ala268Thr。同時基于NeTPhos 3.1的預測結果，Ala268Thr產生了額外的磷酸化位點緊鄰現有的磷酸化位點（T267-p）。此外，Ala268Thr領進下游的ATP綁定位點（圖2A）。
為了驗證錯義突變在蛋白質結構上造成的可能影響，包含Ala268Thr變異的HSPA1L蛋白質結構通過UCSF Chimera進行比較。發現有蛋白質沒有明顯的變化（圖2B），但ADP配體綁定位點的化學鍵長度略有變化（圖2C）。這有可能是小尺寸的Ala到中等尺寸的Thr的原因。而氨基酸上這樣的變化會導致ADP分子的綁定效應。
圖2 HSPA1L和GR在蛻膜化人子宮內膜間質成纖維細胞的蛋白水平
6. HSPA1L Ala268Thr突變體的功能結果
為了研究HSPA1L Ala268Thr突變體是否影響糖皮質激素受體信號通路的活性，對蛻膜化過程中糖皮質激素暴露進行了分析。用含有WT或者Ala268Thr的cDNA的質粒轉入到人子宮內膜基質成纖維細胞中，并用空載體作為對照。細胞
在糖皮質激素（100nM地塞米松）存在下用蛻膜培養基培養72小時作為壓力的替代。用WT HSPA1L-pcDNA 3.1侵入的細胞趨向于比用Ala268Thr HSPA1L-pcDNA3.1侵入的細胞有更大的增長（圖3）。此外，蛋白質印跡分析顯示糖皮質激素的相關胞質蛋白水平在WT和Ala268Thr之間顯著不同，WT組中存在的GR明顯多于Ala268Thr組（圖3）
此外也通過qPCR確定了WNT4的相對基因表達。 WNT4是一個在最近研究中的發現了與妊娠期相關的蛻膜化目標基因。在WT組中觀察到WNT4的表達增加，而在Ala268Thr組中觀察到更不能激活WNT4信號通路，導致WNT4表達降低（p = 0.04）。
Whole exome sequencing reveals HSPA1L as a genetic risk factor for spontaneous preterm birth
PLoS Genetics (2018) 14(7): e1007394
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1007394
背景
早產，定義為在37個完整的妊娠周之前出生，是一個主要的全球性公共衛生問題。全世界每年有超過1500萬嬰兒（超過十分之一的嬰兒）是早產兒和其中有超過一百萬死于與早產相關的并發癥。早產及其并發癥是新生兒的主要死亡原因并成為五歲以下兒童死亡的主要原因。此外，早產兒不僅會導致短期并發癥，而且還會造成終身殘疾，如呼吸和認知障礙。早產也增加成年后發病的風險，如肥胖，糖尿病和心血管疾病。目前，通常沒有有效的預防早產的方法。絕大多數（約70％）早產是在自發性分娩后發生的。大部分自發的早產兒
分娩是自發性的;然而，家族內部的早產復發情況表明遺傳因素可能很重要。遺傳因素估計占出生時間變異的25-40％，母體基因組在早產中起主要作用，但不僅僅是。盡管自發性早產已經有很多遺傳研究在進行，只發現少數變異與此有關
同時其功能含義尚不清楚。
先前自發性早產全基因組關聯分析（GWAS）發現了涉及其中的一些常見變異，但也只解釋了遺傳風險中的一小部分。而稀有變異在自發性早產中的作用基本上是未開發的。全外顯子組測序（WES）識別罕見變異與疾病相關變異為提供了全面的的基礎。以前的早產測序研究或早產分娩前胎膜破裂（PPROM） 只少數候選基因區域，因此錯過了基因組的大部分編碼區。與全基因組測序不同，WES更便宜，也同樣可以解釋結果。
主要材料方法
1. 數據：用于研究自發性早產的群體，包括兩部分，一是研發群體（Discovery population）,從17個芬蘭北部的混合家庭的母親，包括13個已經自發性早產的母親（其中10個妊娠期少于36周且多達復發兩到四次的自發性流產），另外四個為有早產歷史的祖母，早產雙胎妊娠或晚期早產；二是驗證重復群體（Replication population），共有來自丹麥95個家庭的192個女性，這其中包括93對姐妹（姐妹均早產）和兩組三個姐妹均是早產，其中這里早產的定義為37個完整的妊娠周之前完成早產，其中83%的姐妹都有個一次自發性早產，這里所有的女性均是歐洲血統。研發群體的17個個體均進行全血和唾液樣本的DNA采集并通過Illumina HiSeq 2500 進行PE125的全外顯子測序。驗證重復群體的192個個體通過BGI的Exon Kit進行外顯子捕獲并進行PE35的全外顯子測序。
2. 主要分析流程：
圖1 外顯子測序分析流程
a. 變異尋找，利用bwa-mem和GATK進行
b. 變異注釋、過濾和篩選，其中序列覆蓋度<15，變異質量<20被過濾，進一步稀有變異和可能具有功能或造成功能變化的基因被保留。
c. 顯性遺傳基因過濾，群體中所有個體都有的基因中的稀有變異會被考慮調查，當具體某個家庭特殊的分析中，只有家庭內的所有個體均包含的變異會被考慮。
d. 通路分析，Ingenuity Variant Analysis為之前過濾的結果提供了顯著通路注釋，其中P-value通過和已有表型涉及基因進行重跌的Fisher檢測，只有P<0.01的通路用于進一步分析。
e. GWAS分析，結合已有早產相關GWAS數據，包括來自23andMe的43，568個歐洲血統的母親數據，來自Nordic的4，632個歐洲血統的母親數據以及來自芬蘭北部的608個經過質量控制的母親數據。利用Illumina 人類CoreExome芯片進行基因分型，并利用ShapeIT2和IMPUTE2進行prephasing和imputation，關聯分析通過SNPTEST v2.5.2完成。
f. 實驗驗證，通過桑格測序、體外實驗功能驗證、蛋白質模型預測、Western blotting以及qPCR進行等進行驗證。
主要結果
1. 變異分析和通路分析研發群體（Discovery population）。選取了17個個體中情況最嚴重的10個個體進行分析，共在406個基因中鑒定出1，510個符合標準的稀有變異，在這其中鑒定出64個通路，其中三個最顯著的通路（p<=9.80e-7）在所有10個個體均有，為糖皮質激素受體信號、雌激素受體信號傳導和AMPK信號通路?；趩蝹€家庭最少有兩個個體的顯性遺傳模型分析，平均鑒定出在243個基因（173~381）共有444個變異（278~691）通路分析發現糖皮質激素受體信號通路為所有家庭所共有，而雌激素受體信號傳導同為三個家庭所有共有（p<0.01）,其中糖皮質激素受體信號通路和雌激素受體信號通路的一些基因在超過一個家庭中基因型相同，有可能是疾病病因。
驗證重復群體（Replication population）。在以家庭為單位（每個家庭的個體均共享的變異），所有93對姐妹中平均在593個基因（357~1112）中鑒定出807個變異（504~1553），糖皮質激素受體信號通路和雌激素受體信號通路分別在75個和79個家庭中發現。
2. 不同全外顯子分析軟件分析結果比較及兩個群體的稀有變異比較
Ingenuity Variant Analysis, Varseq 和 CMH Variant Warehouse三個外顯子分析軟件被用于分析。只有通過之前優化步驟并且三個軟件中至少兩個軟件的稀有變異被認為是有效的。這樣的好處是極大的降低了分析的假陽性錯誤率，這樣共在研發群體中鑒定出844個變異。而對于驗證重復群體，共鑒定出8，431個變異通過兩個軟件的檢測，其中CMH Variant Warehouse對于該群體不可行。對于兩個群體，變異的效應被分為功能丟失、中等或者其他幾大類。
3. HSPA1L變異與GWAS數據集（40，000母親）的早產相關
稀有變異分析結果和23andMe、北部歐洲的大量母親數據進行GWAS分析發現，在23andMe中的早產數據集中，在糖皮質激素受體信號通路的HSPA1L中的rs34620296的次要等位基因要比對照中基因頻率更高（0.0025而對照僅有0.0010，p=0.002）。同時這樣的關聯和早產時間也是顯著關聯的（p=0.0016，效應值-0.8238，標準誤0.2608）。
表3 HSPA1L變異的GWAS分析結果和自發性早產的關聯
4. 通過Sanger 測序驗證HSPA1L中的變異以及家庭成員的表型
在研究群體中通過Sanger測序驗證了HSPA1L中的兩個造成錯義的稀有變異，rs34620296 和rs150472288。同時這兩個變異在六個來自四個不相干家庭的母親中發現。在驗證群體中的兩個家庭中發現帶有母系遺傳的rs150472288 T等位基因的女性是早產兒，同時，兩個帶有母系遺傳的rs150472288 T等位基因的男性也是早產兒，但是這些攜帶者由于數量過少而難以之間下結論。
5. HSPA1L變異的潛在功能影響評估
對來自研究群體的rs34620296 和rs150472288以及來自驗證重復群體的rs482145 和 rs139193421利用SIFT和PolyPhen-2進行計算機模擬致病性預測。同時，MutationTaster和MutationAssessor將所有四種變異分別預測為致病和預測功能性。根據CADD（Combined Annotation Dependent Depletion）評分（>20），除了rs139193421之外的變異，均為人類基因組中前1%的致死性變異。
表4 HSPA1L錯義變異的功能預測
為了評估這些變異對轉錄活性的潛在影響，利用組蛋白修飾或DNase I超敏反應的證據進行評估。其中HaploReg4.1和RegulomeDB評價的結果顯示所有四種變體都具有組蛋白標記的區域，以及免疫系統各種細胞中強大的轉錄調控特征，尤其是來自外周血的T淋巴細胞（表4）。同時在HeLa-S3宮頸癌細胞系中和包皮成纖維細胞原代細胞分別發現rs34620296和rs482145的積極轉錄證據（表4）。同時在在卵巢組織中和腰肌組織中分別發現rs150472288和rs13919342的1DNA活性的進一步證據（表4）。還有證據表明在卵巢和胎兒腎上腺中rs34620296和rs150472288具有轉錄作用。將來自HaploReg 4.1和RegulomeDB的結果匯集在一起發現，HSPA1L變異參與到內分泌系統以及適應性免疫細胞中。這些變異因此可以在SPTB的病因學中發揮作用。
圖2 HSPA1L變異在蛋白質序列和結構上的效應
通過對HSPA1L變異rs34620296在蛋白質結構的可能效應進行調查，發現這個變異造成了氨基酸變化Ala268Thr。同時基于NeTPhos 3.1的預測結果，Ala268Thr產生了額外的磷酸化位點緊鄰現有的磷酸化位點（T267-p）。此外，Ala268Thr領進下游的ATP綁定位點（圖2A）。
為了驗證錯義突變在蛋白質結構上造成的可能影響，包含Ala268Thr變異的HSPA1L蛋白質結構通過UCSF Chimera進行比較。發現有蛋白質沒有明顯的變化（圖2B），但ADP配體綁定位點的化學鍵長度略有變化（圖2C）。這有可能是小尺寸的Ala到中等尺寸的Thr的原因。而氨基酸上這樣的變化會導致ADP分子的綁定效應。
圖2 HSPA1L和GR在蛻膜化人子宮內膜間質成纖維細胞的蛋白水平
6. HSPA1L Ala268Thr突變體的功能結果
為了研究HSPA1L Ala268Thr突變體是否影響糖皮質激素受體信號通路的活性，對蛻膜化過程中糖皮質激素暴露進行了分析。用含有WT或者Ala268Thr的cDNA的質粒轉入到人子宮內膜基質成纖維細胞中，并用空載體作為對照。細胞
在糖皮質激素（100nM地塞米松）存在下用蛻膜培養基培養72小時作為壓力的替代。用WT HSPA1L-pcDNA 3.1侵入的細胞趨向于比用Ala268Thr HSPA1L-pcDNA3.1侵入的細胞有更大的增長（圖3）。此外，蛋白質印跡分析顯示糖皮質激素的相關胞質蛋白水平在WT和Ala268Thr之間顯著不同，WT組中存在的GR明顯多于Ala268Thr組（圖3）
此外也通過qPCR確定了WNT4的相對基因表達。 WNT4是一個在最近研究中的發現了與妊娠期相關的蛻膜化目標基因。在WT組中觀察到WNT4的表達增加，而在Ala268Thr組中觀察到更不能激活WNT4信號通路，導致WNT4表達降低（p = 0.04）。
小結
本研究通過對兩個不同群體進行全外顯子測序和分析，并通過GWAS檢測到和自發性早產相關變異HSPA1L基因中的Ala268Thr，并通過測序驗證、功能預測、蛋白質結構預測以及表達相關證據共同說明HSPA1L基因中的Ala268Thr變異和自發性早產有直接關聯。- 服務熱線
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